【摘要】：CD47又稱整合素相關(guān)蛋白,是一個五次跨膜蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員。CD47作為最重要的“自我”識別分子表達于大多數(shù)細胞表面。另外,CD47在免疫識別尤其是固有免疫識別中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用,被認為是調(diào)節(jié)固有免疫的檢驗點分子。CD47與骨髓來源的固有免疫細胞尤其是巨噬細胞表面的免疫負調(diào)控分子,信號調(diào)節(jié)蛋白α(Signal regulatory protein alpha,SIRPα)結(jié)合,可以抑制巨噬細胞的吞噬作用。近年來發(fā)現(xiàn)CD47也在大多數(shù)腫瘤中過表達,是腫瘤逃避免疫攻擊的機制之一。因此,阻斷CD47與SIRPα的結(jié)合對于恢復抗腫瘤免疫反應,從而獲得有效的腫瘤免疫治療是一個非常有希望的治療策略。最近采用抗CD47單克隆抗體和SIRPα模擬物在小鼠腫瘤模型中證明,阻斷CD47與SIRPα的結(jié)合可以有效清除包括白血病、淋巴瘤和乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、黑色素瘤、肝癌、非小細胞肺癌等多種實體瘤細胞,明顯抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,并顯著延長荷瘤小鼠的存活期,具有令人鼓舞的治療效果。食管癌在我國是一種高發(fā)腫瘤,其發(fā)病率和死亡率居前五位。目前沒有有效的治療手段。另外,目前也未見針對食管癌CD47的研究和治療報道。因此,在本研究中,制備了一種基因工程改造的單鏈抗體和源自駱駝重鏈可變區(qū)的納米抗體,分析這兩種抗體對CD47結(jié)合SIRPα的阻斷作用,并探討其對巨噬細胞吞噬作用的影響,評價這些小分子抗體對食管癌的治療作用,從而發(fā)展一種新的針對食管癌固有免疫檢驗點的治療方法,為改善食管癌的治療做出貢獻。本研究內(nèi)容主要分為三部分:1.抗CD47納米抗體和單鏈抗體的制備首先,采用人CD47全長基因通過PCR技術(shù)擴增獲得CD47的胞外區(qū)(ECD)基因,構(gòu)建到p ET30a上。原核表達系統(tǒng)表達重組CD47蛋白并鑒定構(gòu)建好的重組CD47抗原。其次,采用噬菌體展示文庫技術(shù)親和篩選抗CD47的納米抗體。構(gòu)建重組CD47的噬菌體展示文庫,經(jīng)過2輪的親和淘洗,獲得了與重組CD47-ECD高親和力的納米抗體VHH-2B1。將VHH-2B1亞克隆到p ET22b載體上,獲得抗CD47的納米抗體;第三,采用DNA合成方法,將抗CD47的單克隆抗體B6H12的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL),通過短肽(Gly4Ser)3連接形成B6H12單鏈抗體(B6H12-sc Fv),親和層析法純化獲得抗CD47的單鏈抗體B6H12-sc Fv。結(jié)果表明,成功的構(gòu)建了p ET30a-CD47質(zhì)粒,誘導表達獲得重組CD47蛋白。通過噬菌體展示文庫篩選技術(shù)獲得了抗CD47的3個納米抗體。又通過基因合成的方法獲得抗CD47的單鏈抗體B6H12-sc Fv。2.抗CD47抗體在體外的結(jié)合活性分析及對食管癌細胞的促吞噬作用首先制備抗CD47小分子納米抗體和單鏈抗體,驗證抗體結(jié)合活性和體外功能方面的作用。ELISA和Western blot方法檢測其與CD47的結(jié)合。同時,采用競爭ELISA分析B6H12-sc Fv對CD47與SIRPα結(jié)合的阻斷能力和食管癌細胞中CD47的表達水平分析及單鏈抗體對食管癌細胞的促吞噬作用。結(jié)果表明,篩選出的納米抗體VHH-2B1與抗原具有與結(jié)合活性,親和系數(shù)4.76×10-8mol/L。ELISA和流式細胞檢測結(jié)果表明B6H12-sc Fv與食管癌細胞EC9706表面CD47較好結(jié)合,而與原核表達的人CD47抗原結(jié)合活性較低。B6H12-sc Fv也可以競爭性阻斷CD47與SIRPα的結(jié)合,且可以促進巨噬細胞吞噬EC9706細胞。3.抗CD47抗體對人食管癌異種移植瘤裸鼠的抑制作用首先,培養(yǎng)EC9706的食管癌細胞,免疫Balb/c裸鼠,每只裸鼠注射EC9706細胞,建立食管癌裸鼠模型。其次,制備納米抗體VHH-2B1及B6H12-sc Fv,每周免疫兩次,空白對照組小鼠免疫DPBS。最后,每周測量腫瘤的體積,稱取瘤塊質(zhì)量,利用統(tǒng)計學分析顯著性差異,發(fā)現(xiàn)并沒有顯著性差異(P0.05)。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,利用抗CD47的抗體對食管癌小鼠進行治療,未達到預期的治療效果。本研究主要通過體內(nèi)體外的實驗驗證制備的抗CD47抗體的治療作用。體外實驗表明制備的抗CD47的抗體與CD47抗原具有結(jié)合活性。體內(nèi)實驗中,建立了食管癌小鼠模型,利用抗CD47的抗體治療,但是沒有達到預期的治療效果。究其原因可能是制備的抗體為小分子抗體,與單抗先比缺少糖基化的位點,在體內(nèi)代謝時間短,治療不易產(chǎn)生效果。其次,制備的抗體具有結(jié)合活性,但是結(jié)合活性還是較弱,導致治療效果不明顯。本研究,成功的制備了抗CD47的抗體,驗證了其功能,為食管癌的治療提供了新的依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：新疆大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R73-36

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本文編號：2330107