鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白的互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）是作為下游蛋白與活化的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白CBL（Calcineurin B-like proteins）相互作用的一類蛋白。二者的相互作用能將植物Ca2+信號傳遞下去,而Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第二信使在植物對抗各種非生物脅迫的防御機制中起著重要的作用。研究表明，CIPK基因家族蛋白廣泛參與植物的逆境脅迫應答和生長發(fā)育調(diào)控，非生物脅迫（Abiotic stresses）因子如干旱、高鹽和低鉀等都能引起植物CIPK基因的上調(diào)表達，其中擬南芥CIPK23基因蛋白在鉀離子代謝中有重要作用。目前，對CIPK基因功能的研究主要集中在擬南芥和水稻中，最近幾年，隨著大規(guī)模植物基因組測序的完成，在楊樹、豌豆和苜蓿等植物中對CIPK基因的研究也越來越深入。煙草是一種重要的模式植物與農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物，對煙草CIPK基因的研究無論是在基礎(chǔ)理論研究領(lǐng)域，還是在通過遺傳育種指導生產(chǎn)實踐領(lǐng)域都具有積極的意義。本研究從煙草中克隆獲得一個新的CIPK基因，命名為NtCIPK23。通過基因序列結(jié)構(gòu)分析、逆境脅迫的表達特征檢測和轉(zhuǎn)基因過表達分析，對NtCIPK23的功能進行了初步的探索。主要工作如下：①結(jié)合生物信息學分析方法，克隆獲得NtCIPK23基因orf編碼區(qū)序列，總長度1350bp，GC含量為42.13%，與蓖麻、楊樹的部分CIPK基因序列相似度在80%以上。NtCIPK23基因編碼450個氨基酸殘基，預測的蛋白質(zhì)分子量為50.702kD，等電點為9.18，親水性的總平均值為-0.3751。比較基因組學分析發(fā)現(xiàn)NtCIPK23對應的蛋白序列在N端蛋白激活結(jié)構(gòu)域和C端NAF結(jié)構(gòu)域比較保守。②半定量RT-PCR分析表明，NtCIPK23基因在轉(zhuǎn)錄水平受干旱脅迫強烈的誘導。在高鹽和SA的脅迫下，NtCIPK23的表達呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，表明NtCIPK23也受這兩種脅迫的誘導表達。但是在冷脅迫下，NtCIPK23并沒有表現(xiàn)出明顯的受誘導表達模式。③為進一步的探索NtCIPK23的功能，本研究將NtCIPK23構(gòu)建到植物超表達TA克隆載體pCXSN中，構(gòu)建成CaMV35S啟動子驅(qū)動的雙元載體pCXSN-35S:NtCIPK23。通過電轉(zhuǎn)化的方法，將該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌LBA4404中，并通過質(zhì)粒PCR以及測序證實獲得陽性克隆。采用葉盤轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)抗性篩選、TAIL-PCR和半定量RT-PCR鑒定證實獲得轉(zhuǎn)基因株系，抗逆相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平較野生型高，為后續(xù)的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

 

重慶大學重慶市211工程院校985工程院校教育部直屬院校

 

 

頁數(shù)：62

 

【學位級別】：碩士

 

文章目錄

摘要

ABSTRACT

1 文獻綜述

    1.1 植物鈣信號系統(tǒng)研究進展

        1.1.1 CaM/CML 信號系統(tǒng)

        1.1.2 CDPK 信號系統(tǒng)

        1.1.3 CBL-CIPK 信號系統(tǒng)

2 引言

    2.1 研究目的及意義

    2.2 主要研究內(nèi)容

    2.3 研究技術(shù)路線

3 煙草 NtCIPK23 基因的克隆與分析

    3.1 實驗材料與試劑

        3.1.1 實驗材料

        3.1.2 實驗試劑

    3.2 實驗方法與步驟

        3.2.1 NtCIPK23 基因的電子克隆

        3.2.2 材料處理

        3.2.3 總 RNA 的提取

        3.2.4 RNA 的消化

        3.2.5 反轉(zhuǎn)錄反應

        3.2.6 cDNA 檢測

        3.2.7 NtCIPK23 基因的 PCR 擴增

        3.2.8 NtCIPK23 基因目的片段的回收

        3.2.9 連接反應

        3.2.10 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

        3.2.11 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定與測序

        3.2.12 半定量 RT-PCR 分析

    3.3 實驗結(jié)果與分析

        3.3.1 煙草葉片總 RNA 的提取及檢測

        3.3.2 煙草 NtCIPK23 的克隆與序列分析

        3.3.3 煙草 NtCIPK23 的表達分析

    3.4 討論

4 煙草 NtCIPK23 轉(zhuǎn)基因

    4.1 實驗材料與試劑

    4.2 實驗方法與步驟

        4.2.1 NtCIPK23 超表達載體的構(gòu)建

        4.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備

        4.2.3 表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

        4.2.4 轉(zhuǎn)基因的操作流程

        4.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的生物學鑒定分析

    4.3 實驗結(jié)果與分析

        4.3.1 NtCIPK23 超表達載體的構(gòu)建

        4.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的生物學鑒定分析

    4.4 討論

5 總結(jié)與展望

致謝

參考文獻

附錄

    A. 發(fā)表的論文

    B. 待發(fā)表的論文

    C. 參加的研究課題

    D. 縮略詞表

 

期刊論文

 

[1]植物CBL/CIPK網(wǎng)絡系統(tǒng)逆境應答研究進展[J]. 趙晉鋒,余愛麗,王高鴻,田崗,王寒玉,杜艷偉,常海霞.  中國農(nóng)業(yè)科技導報. 2011(04)

[2]Identification and characterization of putative CIPK genes in maize[J]. Xifeng Chen~a,Zhimin Gu~b,Dedong Xin~b,Liang Hao~b,Chengjie Liu~b,Ji Huang~a, Bojun Ma~b,Hongsheng Zhang~(a,*) a State Key Lab of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China b College of Chemistry and Life Sciences,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China.  遺傳學報. 2011(02)

[3]淺談煙草鉀素營養(yǎng)[J]. 劉岱松,楊朝輝,石方斌,許樹銀,張友臣,明安祥.  農(nóng)業(yè)科技通訊. 2011(01)

[4]植物鈣依賴性蛋白激酶的進化和功能研究進展[J]. 耿帥鋒,趙永亮,李愛麗,毛龍,王衛(wèi)國,李磊.  河南工業(yè)大學學報(自然科學版). 2010(05)

[5]植物中CBL-CIPK途徑轉(zhuǎn)導特異Ca2+信號的分子機制[J]. 張成偉,王天宇,黎裕.  植物遺傳資源學報. 2010(04)

[6]植物抗逆基因研究進展[J]. 楊柳,張振乾,宋繼金,譚太龍,官春云,劉忠松.  作物研究. 2010(02)

[7]擬南芥與生物脅迫因子相互作用研究進展[J]. 楊寧,王靜.  陰山學刊(自然科學). 2010(01)

[8]鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）介導植物信號轉(zhuǎn)導的分子基礎(chǔ)[J]. 王嬌嬌,韓勝芳,李小娟,谷俊濤,路文靜,肖凱.  草業(yè)學報. 2009(03)

[9]不同供鉀水平下轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙草鉀吸收特征的研究[J]. 聶紅資,楊鐵釗,楊志曉,周繼華,豆顯武.  河南農(nóng)業(yè)科學. 2009(06)

[10]Functions and mechanisms of the CBL-CIPK signaling system in plant response to abiotic stress[J]. Ruifen Li a,1, Junwen Zhang a,b,1, Jianhua Wei a, Hongzhi Wanga, Yanzhen Wanga, Rongcai Ma a, a Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China b Life Science College, Capital Normal University, Beijing 100037, China.  Progress in Natural Science. 2009(06)