鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白的互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）是作為下游蛋白與活化的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白CBL（Calcineurin B-like proteins）相互作用的一類蛋白。二者的相互作用能將植物Ca2+信號(hào)傳遞下去,而Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使在植物對(duì)抗各種非生物脅迫的防御機(jī)制中起著重要的作用。研究表明，CIPK基因家族蛋白廣泛參與植物的逆境脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，非生物脅迫（Abiotic stresses）因子如干旱、高鹽和低鉀等都能引起植物CIPK基因的上調(diào)表達(dá)，其中擬南芥CIPK23基因蛋白在鉀離子代謝中有重要作用。目前，對(duì)CIPK基因功能的研究主要集中在擬南芥和水稻中，最近幾年，隨著大規(guī)模植物基因組測(cè)序的完成，在楊樹(shù)、豌豆和苜蓿等植物中對(duì)CIPK基因的研究也越來(lái)越深入。煙草是一種重要的模式植物與農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)煙草CIPK基因的研究無(wú)論是在基礎(chǔ)理論研究領(lǐng)域，還是在通過(guò)遺傳育種指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐領(lǐng)域都具有積極的意義。本研究從煙草中克隆獲得一個(gè)新的CIPK基因，命名為NtCIPK23。通過(guò)基因序列結(jié)構(gòu)分析、逆境脅迫的表達(dá)特征檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)分析，對(duì)NtCIPK23的功能進(jìn)行了初步的探索。主要工作如下：①結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，克隆獲得NtCIPK23基因orf編碼區(qū)序列，總長(zhǎng)度1350bp，GC含量為42.13%，與蓖麻、楊樹(shù)的部分CIPK基因序列相似度在80%以上。NtCIPK23基因編碼450個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為50.702kD，等電點(diǎn)為9.18，親水性的總平均值為-0.3751。比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NtCIPK23對(duì)應(yīng)的蛋白序列在N端蛋白激活結(jié)構(gòu)域和C端NAF結(jié)構(gòu)域比較保守。②半定量RT-PCR分析表明，NtCIPK23基因在轉(zhuǎn)錄水平受干旱脅迫強(qiáng)烈的誘導(dǎo)。在高鹽和SA的脅迫下，NtCIPK23的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，表明NtCIPK23也受這兩種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。但是在冷脅迫下，NtCIPK23并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的受誘導(dǎo)表達(dá)模式。③為進(jìn)一步的探索NtCIPK23的功能，本研究將NtCIPK23構(gòu)建到植物超表達(dá)TA克隆載體pCXSN中，構(gòu)建成CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙元載體pCXSN-35S:NtCIPK23。通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法，將該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌LBA4404中，并通過(guò)質(zhì)粒PCR以及測(cè)序證實(shí)獲得陽(yáng)性克隆。采用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)抗性篩選、TAIL-PCR和半定量RT-PCR鑒定證實(shí)獲得轉(zhuǎn)基因株系，抗逆相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平較野生型高，為后續(xù)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

 

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頁(yè)數(shù)：62

 

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

 

文章目錄

摘要

ABSTRACT

1 文獻(xiàn)綜述

    1.1 植物鈣信號(hào)系統(tǒng)研究進(jìn)展

        1.1.1 CaM/CML 信號(hào)系統(tǒng)

        1.1.2 CDPK 信號(hào)系統(tǒng)

        1.1.3 CBL-CIPK 信號(hào)系統(tǒng)

2 引言

    2.1 研究目的及意義

    2.2 主要研究?jī)?nèi)容

    2.3 研究技術(shù)路線

3 煙草 NtCIPK23 基因的克隆與分析

    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    3.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

        3.2.1 NtCIPK23 基因的電子克隆

        3.2.2 材料處理

        3.2.3 總 RNA 的提取

        3.2.4 RNA 的消化

        3.2.5 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

        3.2.6 cDNA 檢測(cè)

        3.2.7 NtCIPK23 基因的 PCR 擴(kuò)增

        3.2.8 NtCIPK23 基因目的片段的回收

        3.2.9 連接反應(yīng)

        3.2.10 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

        3.2.11 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定與測(cè)序

        3.2.12 半定量 RT-PCR 分析

    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        3.3.1 煙草葉片總 RNA 的提取及檢測(cè)

        3.3.2 煙草 NtCIPK23 的克隆與序列分析

        3.3.3 煙草 NtCIPK23 的表達(dá)分析

    3.4 討論

4 煙草 NtCIPK23 轉(zhuǎn)基因

    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

    4.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

        4.2.1 NtCIPK23 超表達(dá)載體的構(gòu)建

        4.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備

        4.2.3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

        4.2.4 轉(zhuǎn)基因的操作流程

        4.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的生物學(xué)鑒定分析

    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        4.3.1 NtCIPK23 超表達(dá)載體的構(gòu)建

        4.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的生物學(xué)鑒定分析

    4.4 討論

5 總結(jié)與展望

致謝

參考文獻(xiàn)

附錄

    A. 發(fā)表的論文

    B. 待發(fā)表的論文

    C. 參加的研究課題

    D. 縮略詞表

 

期刊論文

 

[1]植物CBL/CIPK網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)逆境應(yīng)答研究進(jìn)展[J]. 趙晉鋒,余愛(ài)麗,王高鴻,田崗,王寒玉,杜艷偉,常海霞.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào). 2011(04)

[2]Identification and characterization of putative CIPK genes in maize[J]. Xifeng Chen~a,Zhimin Gu~b,Dedong Xin~b,Liang Hao~b,Chengjie Liu~b,Ji Huang~a, Bojun Ma~b,Hongsheng Zhang~(a,*) a State Key Lab of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China b College of Chemistry and Life Sciences,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China.  遺傳學(xué)報(bào). 2011(02)

[3]淺談煙草鉀素營(yíng)養(yǎng)[J]. 劉岱松,楊朝輝,石方斌,許樹(shù)銀,張友臣,明安祥.  農(nóng)業(yè)科技通訊. 2011(01)

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[5]植物中CBL-CIPK途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)特異Ca2+信號(hào)的分子機(jī)制[J]. 張成偉,王天宇,黎裕.  植物遺傳資源學(xué)報(bào). 2010(04)

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[8]鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）介導(dǎo)植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子基礎(chǔ)[J]. 王嬌嬌,韓勝芳,李小娟,谷俊濤,路文靜,肖凱.  草業(yè)學(xué)報(bào). 2009(03)

[9]不同供鉀水平下轉(zhuǎn)AtCIPK23基因煙草鉀吸收特征的研究[J]. 聶紅資,楊鐵釗,楊志曉,周繼華,豆顯武.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2009(06)

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