【摘要】：乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)是一種鐵結合性糖蛋白,因其生物活性功能廣泛,已被應用于醫(yī)藥開發(fā)、食品加工、保健品生產(chǎn)等領域。目前,國內(nèi)外市場上銷售的乳鐵蛋白及其相關產(chǎn)品主要從牛乳中分離純化所得。因其來源的限制,天然乳鐵蛋白的產(chǎn)量已經(jīng)無法滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。因此,利用轉基因技術生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白(RecombinentHuman Lactoferrin,rhLF)作為天然乳鐵蛋白的替代品,已經(jīng)成為研究和開發(fā)乳鐵蛋白的主要途徑。本研究中,使用本實驗室保存的乳腺特異性表達重組人乳鐵蛋白載體菌株,通過擴增后獲得乳腺特異性表達載體(PCL25/hLF),雙酶切并切膠回收目的基因片段(zpz-1);利用細胞顯微注射技術,將zpz-1注射入雌性奶山羊胎兒成纖維細胞(N31);通過G418篩選,獲得16株胎兒成纖維細胞單克隆細胞株。經(jīng)PCR檢測,其中7株整合PCL25/hLF基因。以其中1株(N31zpz-1-13)作為供核細胞,使用核移植、電融合等技術獲得重構胚140枚,移植136枚,共移植9只受體,其中2只受體于移植后第22周分娩,獲得2只雌性奶山羊,分別編號為zp-71和zp-72,只有zp-71健康成長至體成熟。經(jīng)PCR檢測,zp-71整合PCL25/hLF基因。待zp-71體成熟后發(fā)情時進行人工配種,于配種后第22周分娩,連續(xù)收集30天羊乳。ELISA檢測zp-71羊乳清中rhLF的表達水平;使用AKATA蛋白純化系統(tǒng),運用陽離子交換層析技術分離純化rhLF;以青鏈霉素、人初乳濃縮乳清為陽性對照,以正常羊乳濃縮乳清為陰性對照,以純化的rhLF(lmg)、轉基因奶山羊zp-71的濃縮乳清為實驗組,制備藥敏紙片,進行抑菌試驗。ELISA檢測zp-71乳清中rhLF的結果顯示:轉基因奶山羊zp-71分娩后連續(xù)30天的乳清中均含有rhLF。對比天然乳鐵蛋白的表達特點,本驗室保存的PCL25/hLF表達載體(含β-casin與CMV復合啟動子)能在轉基因羊乳腺中有效穩(wěn)定地表達。離子交換層析的結果顯示:以0.5MNaCl-HAC-Tris作為洗脫液進行洗脫,得到兩個洗脫峰。SDS-PAGE電泳結果及凝膠成像結果顯示:洗脫峰Ⅰ中含有多條帶,洗脫峰Ⅱ為單一條帶;Western Blotting結果顯示:洗脫峰Ⅱ中的產(chǎn)物為rhLF。抑菌試驗結果顯示:轉基因奶山羊zp-71的乳清及其純化產(chǎn)物均具有抑菌活性,4h的抑菌圈分別為1.70cm和1.30cm。本研究表明:應用實驗室前期構建的PCL25/hLF乳腺特異性表達載體制備的轉基因山羊具有乳腺特異表達rhLF功能;并且,重組人乳鐵蛋白表達產(chǎn)物可以從轉基因羊乳汁中提取;提取獲得的rhLF和濃縮的轉基因乳清抑菌試驗顯示均有抑菌活性。由此證明:人乳鐵蛋白基因轉基因山羊乳腺中表達的重組人乳鐵蛋白在乳汁中單獨存在,而且具有與天然人乳鐵蛋白相似的抗菌活性。研究也表明:運用以HAC-Tris-NaCl為緩沖體系進行洗脫的陽離子交換層析技術可有效提取轉基因羊乳中的rhLF,這一結果在國內(nèi)外尚未見報道。同時此方法的建立也為轉基因奶山羊乳中重組人乳鐵蛋白的提取建立了技術基礎,為今后工業(yè)化大規(guī)模分離純化rhLF提供參考。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TQ931;S827

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本文編號：2299709