【摘要】：前期研究表明,抑制素基因免疫通過中和內(nèi)源性抑制素,可促進FSH的分泌,進而促進卵泡發(fā)育和排卵,提高動物繁殖性能。本實驗室構(gòu)建了以減毒沙門氏菌為載體的抑制素基因疫苗C501(pVAX-asd-IS),其制備簡便,便于擴大生產(chǎn)。在免疫小鼠后,提高了其大卵泡的數(shù)量和產(chǎn)仔數(shù)。且該疫苗沒有抗生素抗性基因,不會造成抗生素危害,有利于在大動物上的推廣應(yīng)用。但在不同的物種中,抑制素基因免疫的效果也受到免疫接種途徑、免疫劑量和免疫次數(shù)等因素的影響。且在臨床應(yīng)用和環(huán)境釋放的安全性方面,特別是在水牛臨床試驗的安全性方面尚未研究。因此,本研究分別分析了抑制素基因疫苗肌注免疫的劑量和鼻飼免疫的天數(shù),對雜交水牛在繁殖季節(jié)的卵泡發(fā)育、發(fā)情排卵和受胎的影響。挑選出免疫效果最佳的免疫劑量和天數(shù),再比較以上兩種免疫途徑對雜交水牛在非繁殖季節(jié)的卵泡發(fā)育、發(fā)情排卵和受胎的影響。分析抑制素基因疫苗在繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)應(yīng)用于雜交水牛的促卵泡生長發(fā)育和排卵的效果,并從水牛臨床應(yīng)用和環(huán)境釋放角度,分析抑制素基因疫苗的安全性,為促進抑制素基因疫苗的推廣應(yīng)用和優(yōu)化提高雜交水牛繁殖性能的新技術(shù)奠定了基礎(chǔ),主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1.抑制素基因疫苗肌肉注射劑量對雜交水牛卵泡發(fā)育和發(fā)情排卵及受胎的影響選擇158頭雜交水牛分為四組,其中免疫組T1(n=41)、T2(n=37)和T3(n=37)分別注射1010、109和108 CFU/ml的抑制素重組菌C501(pVAX-asd-IS),10ml/頭,對照組(n=43)注射PBS,初次免疫為第0天,加強免疫在第14天。所有牛只在第28天肌肉注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)1000IU,第30天注射氯前列腺素(PGF2ɑ)0.5mg,48小時后注射200μg促性腺激素釋放激素(GnRH)。進行B超檢測,記錄卵泡發(fā)育和排卵情況。結(jié)果顯示肌肉注射免疫抑制素重組菌C501(pVAX-asd-IS)后,各免疫組雜交水牛均能產(chǎn)生抗抑制素IgG抗體,以1010 CFU/ml劑量組的抗體水平最高。1010 CFU/ml劑量組的大卵泡(≥10mm)和排卵卵泡的數(shù)量與直徑顯著(P0.05)高于對照組,且優(yōu)勢卵泡的生長速度顯著高于108 CFU/ml劑量和對照組(P0.05)�？贵w陽性組的發(fā)情、排卵和受胎率顯著高于抗體陰性組。以上結(jié)果說明以1010 CFU/ml的抑制素重組基因疫苗C501(pVAX-asd-IS)肌肉注射免疫雜交水牛,能顯著促進卵泡的生長發(fā)育,促進雜交水牛的發(fā)情和排卵,提高其繁殖性能。2.抑制素基因疫苗鼻飼免疫天數(shù)對雜交水牛卵泡發(fā)育和發(fā)情排卵及受胎的影響選擇134頭雜交水牛分為4組:免疫5天組(n=34)、免疫3天組(n=35)和免疫1天組(n=31)分別用1010 CFU/ml C501(pVAX-asd-IS)疫苗連續(xù)鼻飼免疫5、3和1天,10ml/頭,每天噴鼻兩次。對照組(n=34)使用10ml PBS鼻飼免疫5天。所有牛只初次免疫為第0天,加強免疫在第14天。且在第28天注射促性腺激素釋放激素(GnRH)200μg,第35天注射氯前列腺素(PGF2α)0.5mg,第37天再次注射促性腺激素釋放激素(GnRH)200μg,在之后的18和24小時進行人工授精。B超檢測記錄卵泡發(fā)育和排卵情況。結(jié)果顯示在初次免疫后的14和28天,鼻飼免疫C501(pVAX-asd-IS)能引起顯著的免疫反應(yīng),免疫5天組的抗抑制素IgG抗體水平顯著高于免疫1天組(P0.01)。且加強免疫后抗體水平有上升的趨勢。在二次注射GnRH后,免疫5天組的優(yōu)勢卵泡增長速度顯著快于對照組和免疫1天組,且免疫5天組的大卵泡(≥10mm)和排卵卵泡的數(shù)量和直徑高于其他各組,使得免疫5天組有較高的發(fā)情、排卵和受胎率。結(jié)果表明,以抑制素重組基因疫苗C501(pVAX-asd-IS)鼻飼免疫5天,能顯著促進水牛的卵泡生長和發(fā)情排卵,與Ovsynch-TAI相結(jié)合,可提高雜交水牛在繁殖季節(jié)的受胎率。3.抑制素基因疫苗兩種免疫途徑對雜交水牛在非繁殖季節(jié)的卵泡發(fā)育和發(fā)情排卵及受胎的影響選取81頭經(jīng)產(chǎn)雜交水牛隨機分為三組:肌肉注射組(n=29)肌注1010 CFU/ml抑制素重組菌苗C501(pVAX-asd-IS),10ml/頭,每天一次,免疫3天;鼻飼免疫組(n=27)鼻飼1010 CFU/ml抑制素重組菌苗C501(pVAX-asd-IS),10ml/頭,每天兩次,免疫5天;對照組C(n=25)每頭肌肉注射10ml PBS,每天一次,共注射5天。初次免疫為第0天,加強免疫在第14天。全體牛只在第28天肌肉注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)1000IU,第30天注射氯前列腺素(PGF2ɑ)0.5mg,48小時后注射200μg促性腺激素釋放激素(GnRH)。B超檢測記錄卵泡發(fā)育和排卵情況。研究結(jié)果顯示以肌肉注射和鼻飼免疫雜交水牛,均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗抑制素抗體,且兩種免疫方式的抗體水平差異不顯著。但肌肉注射組的抗體陽性率高于鼻飼免疫組(82.8%vs.74.1%)。兩種免疫方式均能增加大卵泡和排卵卵泡的數(shù)量和直徑,以肌肉注射的效果較強。在非繁殖季節(jié),肌肉注射組雜交水牛的發(fā)情、排卵和受胎率均高于鼻飼免疫組和對照組,且與繁殖季節(jié)的發(fā)情、排卵和受胎率相當(dāng)�？贵w陽性牛的受胎率也顯著高于抗體陰性牛(56.8%vs.27.0%;P0.01)。結(jié)果表明,以肌肉注射和鼻飼免疫抑制素基因疫苗C501(pVAX-asd-IS)均能誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng),但以肌肉注射的免疫效果更優(yōu),能顯著增加成熟卵泡的數(shù)量和直徑,提高雜交水牛在非繁殖季節(jié)的發(fā)情,排卵和受胎率。4.抑制素基因疫苗的生物安全性評價選用81頭經(jīng)產(chǎn)雜交水牛隨機分為三組:肌肉注射組(n=29)肌注1010 CFU/ml抑制素重組菌苗C501(pVAX-asd-IS),10ml/頭,每天一次,免疫3天;鼻飼免疫組(n=27)鼻飼1010 CFU/ml抑制素重組菌苗C501(pVAX-asd-IS),10ml/頭,每天兩次,免疫5天;對照組C(n=25)每頭肌肉注射10ml PBS,每天一次,共注射5天。初次免疫為第0天,加強免疫在第14天。對免疫后雜交水牛的體溫和心率進行監(jiān)測,并對糞便、水和土壤樣本進行采集,用PCR方法檢測inv A基因。結(jié)果表明各組雜交水牛在免疫后未出現(xiàn)臨床癥狀,其體溫和心率正常。在糞便、水和土壤樣本中均未檢測到inv A目的基因。說明以肌肉注射和鼻飼免疫抑制素重組菌苗,在雜交水牛上的運用是安全的,且重組菌苗不會通過牛體向外界傳播,對環(huán)境不會產(chǎn)生不利影響。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823.83

【參考文獻】

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本文編號：2294926