【摘要】：研究目的:p53抑制因子iASPP在急性白血病中高表達(dá),抑制白血病細(xì)胞凋亡,促進(jìn)白血病發(fā)生。為明確其機(jī)制,我們通過酵母雙雜交技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)FHL2能夠與iASPP相互作用,并對FHL2和iASPP的相互作用對白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制進(jìn)行了深入研究。研究方法:通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出與iASPP相互作用的蛋白FHL2。利用實時定量PCR方法檢測急性白血病病人和白血病細(xì)胞系中FHL2基因的表達(dá)水平。利用免疫熒光共聚焦、免疫共沉淀和免疫印跡方法證明FHL2和iASPP相互作用。構(gòu)建pcDNA3.1-FHL2-myc表達(dá)載體及FHL2各個結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體,分別與pcDNA3.1-iASPP-flag共同過表達(dá)于293T細(xì)胞,通過免疫共沉淀聯(lián)合免疫印跡技術(shù)確定與iASPP相互作用的FHL2的具體結(jié)構(gòu)域。分別構(gòu)建FHL2和iASPP的shRNA干擾載體PLKO.1,制備慢病毒并感染K562和Kasumi-1細(xì)胞,敲降FHL2或iASPP表達(dá)水平;利用MTT方法檢測細(xì)胞增殖,以流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的變化;利用免疫印跡方法分析細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和抗凋亡蛋白的表達(dá)水平。通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測FHL2和iASPP的相互作用對p53下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。研究結(jié)果:FHL2在初治急性紅白血病病人中的表達(dá)水平明顯高于其它急性髓細(xì)胞白血病亞型,在K562、Kasumi-1細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于KG-1a、NB4、U937和SKNO-1等其它白血病細(xì)胞系。FHL2和iASPP能夠相互作用,有亞細(xì)胞共定位現(xiàn)象,且FHL2的L1/2-3部分是與iASPP相互作用的必需結(jié)構(gòu)域。無論干擾FHL2還是iASPP的表達(dá),K562和Kasumi-1細(xì)胞增殖都明顯受到抑制,細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期;p21和p27表達(dá)明顯增加,CDK4、E2F1、CyclinE和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。在K562和Kasumi-1細(xì)胞中,干擾FHL2的表達(dá)后,iASPP的表達(dá)也減少,同樣,干擾iASPP的表達(dá)后,FHL2的表達(dá)也減少,表明兩者的表達(dá)具有協(xié)同一致性。iASPP抑制p53對BAX轉(zhuǎn)錄激活作用的同時,再轉(zhuǎn)入shFHL2,能夠逆轉(zhuǎn)iASPP對p53的抑制作用,且具有劑量依賴性。研究結(jié)論:FHL2在急性紅白血病中的表達(dá)水平高于其它急性髓細(xì)胞白血病亞型。本研究首次發(fā)現(xiàn)FHL2和iASPP在AML細(xì)胞中相互結(jié)合。敲降FHL2或iASPP的表達(dá)可明顯抑制K562和Kasumi-1白血病細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞阻滯于G0/G1期;同時p21和p27表達(dá)增加,CDK4、E2F1、CyclinE和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。FHL2和iASPP的表達(dá)具有協(xié)同一致性。另外,iASPP和FHL2參與調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄激活作用。以上研究結(jié)果提示FHL2有望成為AML潛在的新的治療靶點。研究目的:在對臨床工作中遇到的疑難急性髓系白血病(AML)M5b病例研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個新的t(11;16)(q23;p13)變異易位。我們利用轉(zhuǎn)錄組測序和PCR方法發(fā)現(xiàn)并鑒定了 MLL-MYH11融合基因,這是目前尚未報道過的MLL融合基因。本研究通過對全新的MLL融合基因進(jìn)行編碼序列擴(kuò)增和蛋白結(jié)構(gòu)分析,從而進(jìn)一步增加人們對MLL融合基因的認(rèn)識。研究方法:采用轉(zhuǎn)錄組測序方法發(fā)現(xiàn)MYH11是MLL的對手基因,通過PCR鑒定患者確實攜帶全新的融合基因MLL-MYH11。通過PCR分段擴(kuò)增MLL-MYH11,以overlap PCR或酶切連接方法將各段序列連接起來,并構(gòu)建MLL-MYH11的慢病毒載體。用多聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,利用real-time PCR 鑒定 MLL-MYH11 的 mRNA 表達(dá)水平。研究結(jié)果:我們對臨床工作中遇到的一例攜帶t(11;16)(q23;p13)染色體易位的疑難AMILM5b病例進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)了一個全新的MLL融合基因—MLL-MYH11融合基因。MLL-MYH11融合基因全長9948bp,編碼一個含有3315個氨基酸殘基的融合蛋白。MLL-MYH11融合基因符合MLL融合基因的特點,累及MLL基因并且包含MLL基因7號外顯子及其5'序列,所編碼的融合蛋白含有MLL的3個AT吊鉤(AThooks),2個核定位信號:SNL1和SNL2,1個轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域:RD1和RD2,以及MYH11的全部編碼序列。HEK293T轉(zhuǎn)染MLL-MYH11融合基因后,其mRNA水平顯著升高,但未檢測到融合蛋白。研究結(jié)論:在本次研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個全新的MLL融合基因MLL-MYH11,并擴(kuò)增得到其編碼序列全長,分析了該融合蛋白的結(jié)構(gòu),其在白血病發(fā)生中的作用尚待進(jìn)一步研究。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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