【摘要】：目的構(gòu)建穩(wěn)定的α7神經(jīng)型尼古丁受體(α7 nAChR)過表達的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y,研究α7 nAChR過表達對鈣調(diào)蛋白(CaM)表達水平的影響。方法設(shè)計α7 nAChR引物并擴增α7 nAChR特異性編碼的核苷酸序列,退火后克隆至pc DNA 3.1質(zhì)粒,構(gòu)建α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒。將α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞,用含G418的培養(yǎng)液篩選,挑選陽性克隆后采用實時熒光定量(Realtime)PCR和蛋白質(zhì)印跡方法檢測轉(zhuǎn)染細胞中α7 nAChR mRNA及蛋白表達水平的變化,蛋白質(zhì)印跡方法檢測CaM表達水平的變化。結(jié)果構(gòu)建的α7 nAChR mRNA過表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細胞后,經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆株,與對照組相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表達量分別增加了533%和110%,CaM表達量增加了43%。結(jié)論成功構(gòu)建了α7 nAChR mRNA過表達的SH-SY5Y細胞株,α7 nAChR表達上調(diào)增加了CaM表達水平,這可能與阿爾茨海默病的發(fā)病有一定的關(guān)系。
[Abstract]:Objective to construct a stable 偽 7 neuronal nicotine receptor (偽 7 nAChR) overexpressed neuroblastoma cell line SH-SY5Y, to study the effect of 偽 7 nAChR overexpression on the expression of calmodulin (CaM). Methods 偽 7 nAChR primers were designed and the nucleotide sequences specifically encoded by 偽 7 nAChR were amplified and cloned into pc DNA 3.1 plasmid after annealing. The recombinant plasmid 偽 7 nAChR-pcDNA 3.1 was constructed. The recombinant plasmid 偽 7 nAChR-pcDNA 3.1 was transfected into SH-SY5Y cells. The positive clones were selected and the expression levels of 偽 7 nAChR mRNA and protein in the transfected cells were detected by real-time fluorescent quantitative (Realtime) PCR and Western blotting. The expression of CaM was detected by Western blot. Results the 偽 7 nAChR mRNA overexpression plasmid was successfully transferred into SH-SY5Y cells, and stable transfected cell lines were obtained by G418 screening. Compared with the control group, the expression of 偽 7 nAChR mRNA and protein increased by 533% and 110%, respectively. Conclusion A SH-SY5Y cell line with overexpression of 偽 7 nAChR mRNA was successfully constructed, and the expression of 偽 7 nAChR increased CaM expression, which may be related to the pathogenesis of Alzheimer's disease.
【作者單位】： 貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室;貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(81360178) 教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助”(IRT13058) 貴州省科技廳重大專項(黔科合重大專項字2014〔6008〕);貴州省科技廳項目(201344,黔科合SY字〔2013〕3020)
【分類號】：R749.16

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本文編號：2264483