【摘要】：魚(yú)類的生殖發(fā)育及調(diào)控機(jī)制一直都是生命科學(xué)研究的重要課題之一,不僅有重要的理論意義,而且在指導(dǎo)魚(yú)類品種改良上有重要應(yīng)用。精子活力作為雄性生殖能力的重要指標(biāo),直接影響著受精率的高低和后代品質(zhì),提高雄性精子活力是魚(yú)類品種改良的重要方向。本研究分別以黃顙魚(yú)為研究對(duì)象,鑒定并分析了與其性別相關(guān)的基因;以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象,尋找到一個(gè)對(duì)其精子活力有調(diào)控功能的mi RNA。為了探索黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)性別分化和性腺發(fā)育的分子機(jī)制,我們?cè)邳S顙魚(yú)性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到13個(gè)相關(guān)基因。表達(dá)譜分析表明,雄性相關(guān)基因中,piwi-1和amhr2在XY雄魚(yú)和YY超雄魚(yú)中的表達(dá)量明顯高于XX雌魚(yú),amh在XY雄魚(yú)中的表達(dá)量高于XX雌魚(yú)和YY超雄魚(yú)。雌性相關(guān)基因中,cyp19a和foxl2在XY雄魚(yú)和YY超雄魚(yú)中幾乎不表達(dá),但在XX雌魚(yú)中有一定表達(dá)。從中選取amh和amhr2兩個(gè)基因作進(jìn)一步研究,在一齡黃顙魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸和肝臟中,amh和amhr2均在雌雄性腺中的表達(dá)量最高;amh在雄魚(yú)性腺和垂體中的表達(dá)量顯著高于雌魚(yú),而在雌魚(yú)肝臟中的表達(dá)量高于雄魚(yú);amhr2在雌、雄黃顙魚(yú)性腺中表達(dá)差異不顯著,而在雄魚(yú)下丘腦、垂體和肝臟中的表達(dá)水平顯著高于雌性。XY雄魚(yú)腹腔注射EE2(17α-ethinylestradiol,17α-乙炔雌二醇)后,amh和amhr2的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢(shì)。XX雌魚(yú)腹腔注射MT(17α-methyltestosterone,17α-甲基睪酮)后,amh的表達(dá)量在48和72 hpt時(shí)均低于正常水平,120 hpt恢復(fù)正常;amhr2的表達(dá)量在48 hpt顯著下調(diào),72和120 hpt時(shí)約為正常水平的一半。本研究鑒定了黃顙魚(yú)性別相關(guān)基因并分析了其表達(dá)模式,為進(jìn)一步研究黃顙魚(yú)性別決定和分化機(jī)制提供了借鑒意義。精子活力受到體內(nèi)和體外多重因素的影響,精子發(fā)生中每一個(gè)過(guò)程都會(huì)影響到最終精子的活力,miR-34家族在很多研究中都被報(bào)道與性腺發(fā)育和精子發(fā)生相關(guān)。為了探究miR-34a對(duì)斑馬魚(yú)精子活力的作用,我們使用改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了miR-34a-/-(miR-34a純合突變體)斑馬魚(yú),經(jīng)過(guò)精子活力測(cè)量和比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)miR-34a-/-斑馬魚(yú)精子活力高于WT(wild type,野生型)斑馬魚(yú),激活精子的VAP(average path velocity,平均路徑速度)、VSL(straight line velocity,直線運(yùn)動(dòng)速度)、VCL(curvilinear velocity,曲線運(yùn)動(dòng)速度)等參數(shù)顯著性高于WT斑馬魚(yú)(P0.05),前進(jìn)性運(yùn)動(dòng)精子的VAP、VSL、VCL等參數(shù)極顯著性高于WT斑馬魚(yú)(P0.01)。通過(guò)文獻(xiàn)檢索,我們知道哺乳動(dòng)物中Gsk3a、Wt1等任一基因的突變或缺失都會(huì)對(duì)精子發(fā)生或精子活力造成某種傷害,上述發(fā)現(xiàn)都直接或間接證明了上述基因?qū)踊盍Φ纳险{(diào)作用,而我們通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn),斑馬魚(yú)中上述基因或其等位基因的3’UTR區(qū)均存在與miR-34a種子區(qū)域(5’-...GGCAGU...-3’)互補(bǔ)配對(duì)的序列,這說(shuō)明miR-34a可能靶向調(diào)控上述基因,從而影響斑馬魚(yú)精子活力。檢測(cè)mi R-34a-/-斑馬魚(yú)肝臟、精巢、腦中上述miR-34a預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)每個(gè)基因的表達(dá)量都在一個(gè)或多個(gè)組織顯著性升高。本研究證實(shí)了miR-34a對(duì)斑馬魚(yú)精子活力和上述預(yù)測(cè)靶基因具有負(fù)調(diào)控作用,miR-34a與其預(yù)測(cè)靶基因是斑馬魚(yú)精子活力基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2257323