【摘要】：近年來大量研究表明,表觀遺傳修飾異常不但影響神經(jīng)元的發(fā)育及突觸可塑性,而且和多種認知障礙性神經(jīng)精神疾病密切相關。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化及去甲基化、組蛋白乙�；�、非編碼micro RNA干擾等多種不涉及DNA序列改變而對基因功能進行的可逆可遺傳性調節(jié)過程。DNA甲基化(DNA Methylation)是表觀遺傳修飾的一種重要形式,通過游離甲基與雙鏈DNA序列上Cp G島的胞嘧啶堿基C5碳原子的共價結合來實現(xiàn)。DNA甲基化過程由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases,Dnmts)催化完成。真核生物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內的DNA甲基化酶主要包括Dnmt1,Dnmt3a以及Dnmt3b三種。雖然Dnmt3b在成熟神經(jīng)元內的表達水平明顯下降,但其對突觸可塑性和記憶形成仍有重要的調節(jié)作用。已有研究證據(jù)表明Dnmt3b參與學習記憶的相關過程,但其內在分子生物學機制尚未闡明。因此,為了更加深入的探討Dnmt3b基因在成熟神經(jīng)系統(tǒng)學習記憶過程中的作用及機制,我們用AAV-Cre-GFP病毒定位注射的方法條件性敲除Dnmt3b基因在小鼠海馬CA1區(qū)的表達,同時用αCa MKII-Cre工具鼠建立αCa MKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox條件性興奮性神經(jīng)元基因敲除小鼠,應用高架十字迷宮、曠場實驗、新物體識別、新位置識別、Morris水迷宮等行為學范式對兩種條件性敲除小鼠學習記憶能力進行測試。并應用原代細胞培養(yǎng)、鈣離子成像、基因表達譜芯片等技術從細胞水平及分子水平進一步探討其內在機制。結果如下:1.慢病毒注射方法在成年小鼠海馬CA1區(qū)敲除Dnmt3b基因后,小鼠自發(fā)活動、探索能力均未受到影響,且不存在焦慮等情緒障礙。2.成年小鼠海馬CA1區(qū)條件性Dnmt3b基因敲除影響小鼠的位置識別記憶。3.αCaMKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox基因敲除小鼠的自發(fā)活動及焦慮狀態(tài)無異常。4.αCa MKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox基因敲除小鼠表現(xiàn)出位置識別記憶障礙。5.慢病毒敲除Dnmt3b基因不影響原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(DIV 21天)樹突形態(tài)及興奮性突觸形成。6.慢病毒敲除Dnmt3b基因增加原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(DIV 21天)谷氨酸(50μM)誘導的胞體內鈣濃度增加。7.用基因表達芯片技術分別對AAV病毒注射小鼠以及αCaMKII-Cre條件性基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)的差異表達基因進行了篩選,篩選出的差異表達基因用real-time q RT-PCR進行驗證,結果顯示,α-2,6唾液酸糖基轉移酶(betagalactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 2,St6gal2)在病毒注射小鼠以及αCa MKII-Cre條件敲除小鼠海馬CA1區(qū)的表達均上調,差異達2.5倍以上,且有統(tǒng)計學意義。8.條件性敲除小鼠海馬神經(jīng)元中的Dnmt3b基因引起小鼠海馬區(qū)Dnmt1及Dnmt3a的表達量代償性增高。而新物體識別(NPR)訓練1h后條件性敲除小鼠海馬區(qū)Dnmt1基因表達顯著下降。綜上所述,在病毒介導的局部腦區(qū)基因敲除和遺傳性條件性基因敲除兩種模型小鼠上,我們研究發(fā)現(xiàn),條件性敲除小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元中Dnmt3b基因可導致小鼠海馬依賴的物體位置識別記憶障礙。Dnmt3b基因敲除不影響海馬神經(jīng)元的樹突形態(tài)及興奮性突觸形成,但是可明顯促進谷氨酸誘導的胞內鈣離子濃度的增加,提示Dnmt3b基因敲除顯著增加海馬神經(jīng)元的活動。根據(jù)基因芯片篩選并驗證的結果,我們推測Dnmt3b基因敲除上調了唾液酸糖基轉移酶的表達,并通過改變神經(jīng)元內糖蛋白及糖脂的唾液酸酸化作用造成海馬神經(jīng)元的過度激活及鈣超載,從而影響了海馬神經(jīng)環(huán)路突觸的傳遞及(或)可塑性,并影響了小鼠的物體位置識別記憶過程,內在的細胞及突觸傳遞等具體機制還有待進一步研究。為驗證這一假說,我們正在進行的實驗包括:(1)用western blot的方法分析DNMTs,St6gal2和它的反應底物PSA-NCAM蛋白在海馬的表達。(2)在腦片上用電生理方法記錄海馬突觸傳遞及可塑性變化。(3)考察海馬CA1區(qū)注射St6gal2抗體或病毒介導特異性sh RNA表達,以拮抗St6gal2表達上調,是否能反轉dnmt3b敲除引起的物體位置識別記憶障礙。值得注意的是,我們還發(fā)現(xiàn),正常小鼠新物體識別(NPR)實驗訓練后海馬區(qū)Dnmt1基因的表達顯著下降,提示Dnmt1基因表達的可塑性下調可能與小鼠NPR記憶的形成相關。Dnmt3b基因敲除引起的Dnmt1和Dnmt3a的表達代償性增加,可能阻礙了這種活動依賴性的Dnmt1可塑性下調,從而參與了位置識別記憶障礙的形成。因此,我們認為直接分子機制(St6gal2表達上調)和間接分子機制(Dnmt1代償性上調)可能共同參與了海馬Dnmt3b基因敲除所致的新物體識別記憶障礙形成,具體機制有待進一步深入研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749

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本文編號：2254458