【摘要】：胚胎由一個全能的受精卵分裂形成多個發(fā)育潛力幾乎相同的卵裂球,隨著胚胎的形態(tài)的不斷變化,形成一個空腔,此時,卵裂球隨之分化形成內(nèi)細胞團(Inner cell mass,ICM),后續(xù)發(fā)育成為胎體和部分胎盤組織,和外層的滋養(yǎng)層細胞(Trophoblast,TE),其后發(fā)育成為胎盤部分。TE在胚胎植入和妊娠維持中起重要作用。前人研究表明抑制水牛早期囊胚內(nèi)FGF信號通路能夠提高囊胚整體的細胞數(shù),而且細胞數(shù)的增加主要來自滋養(yǎng)層。另外在豬的研究也表明,抑制FGF信號通路可以在不影響胚胎正常發(fā)育和相關(guān)多能性基因的表達的前提下,顯著提高滋養(yǎng)層標志基因CDX2的表達量,然而激活FGF信號通路可以使得CDX2的表達量明顯下降。雖然機理暫時不明,但是這有可能成為一個極其有前景的研究方向。目前對豬早期胚胎內(nèi)滋養(yǎng)層的研究甚少,對于在早期胚胎內(nèi)滋養(yǎng)層的發(fā)育情況,并沒有一個衡量其發(fā)育潛力的標準。通常都以滋養(yǎng)層標志基因CDX2的表達量作為滋養(yǎng)層細胞發(fā)育情況的標準�；谧甜B(yǎng)層在胚胎在子宮中的定位、附著、侵入過程中的重要地位,建立一個衡量其發(fā)育潛力的標準以及提高其細胞數(shù)和相關(guān)標志/功能基因的表達,為提高后續(xù)的胚胎移植效率提供了一種非常有實際意義的探討。本研究主要內(nèi)容如下:對成熟卵細胞進行孤雌激活(Parthenogenetic activation,PA)后,分別添加濃度為5μM、10μM、15μM、20μM的FGF信號通路抑制劑BGJ-398到基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)168h收集囊胚,與DMSO對照組對比囊胚率、囊胚內(nèi)滋養(yǎng)層細胞數(shù)和相關(guān)基因表達量進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1.在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加BGJ398并不影響囊胚的形成和正常發(fā)育,但是與DMSO對照組相比,5μM組囊胚率有顯著提高(29.64%vs 22.97%,P0.05),10μM組囊胚率有一定增長但是差異并不顯著(24.68%vs 22.97%,P0.05)。當濃度增加到15μM、20μM時,囊胚率降低,說明濃度過高對囊胚的形成起到抑制作用。對囊胚進行Hoechst染色細胞手動計數(shù),與對照組相比,5μM組囊胚細胞數(shù)有顯著提高(54.2±7.92vs45.16±8.75,P0.05),10μM組囊胚細胞數(shù)有一定增長但是差異并不顯著(45.16±8.75 vs 48.2±4.32,P0.05),15μM、20μM組囊胚平均細胞數(shù)均少于對照組。選取最優(yōu)濃度實驗組5μM對囊胚多能性相關(guān)基因表達量進行檢測。結(jié)果表明相對于對照組,處理組的多能性相關(guān)基因KLF4的表達量顯著提高了 6.28倍(P0.05),而OCT4表達量為對照組的1.50倍(P0.05),差異不顯著;原始外胚層標志基因SOX2的表達量顯著提高了 3.45倍(P0.05);囊胚內(nèi)滋養(yǎng)層標志基因CDX2表達量顯著提高了 2.93倍(P0.05)。2.BGJ398促進以豬PA囊胚滋養(yǎng)層相關(guān)標志基因的表達。通過PCR檢測我們發(fā)現(xiàn):GATA3,TEAD4,CCDX2,OCT4,TERT,OEMES,FGFR2在囊胚中均有表達。但是PPARγ,HAND1,MMP2,MMP9以及ELF5,CYP11A1,HSD17B1沒有檢測到表達。上述結(jié)果提示GATA3,TEAD4,CDX2,OCT4,TERT,OEMES,FGFR2可以作為后續(xù)實驗中滋養(yǎng)層細胞檢測的評價基因。選取5μM處理組和有報道過的10μM處理組的囊胚對篩選出的滋養(yǎng)層標志物表達量進行定量分析,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,調(diào)控滋養(yǎng)層形成與分化的CDX2的上游基因GATA3表達量在5μM組和10μM組分別提高了 1.49倍和2.14倍(P0.05),但差異不顯著;端粒酶活性基因TERT的表達得到了顯著提高,與對照組相比分別提高了 3.03倍和1.70倍(P0.05);CDX2上游調(diào)控因子TEAD4表達量也得到顯著提高,5μM組和10μM組表達量分別為對照組的2.00倍和2.09倍(P0.05);FGFR2由于通路抑制表達量隨著抑制劑濃度上升而降低;5μM組和10μM組EOMES表達量分別為對照組的3.18倍(P0.05)和1.52倍(P0.05)。上述實驗結(jié)果說明BGJ398能夠促進滋養(yǎng)層細胞功能相關(guān)基因GATA3,TEAD4 CDX2,OCT4,TERT,OEES表達量的顯著提高,推測 BJG398能夠提高滋養(yǎng)層細胞發(fā)育潛力,從而可能間接提高胚胎著床能力。綜上所述,在豬胚胎培養(yǎng)基添加5μMBGJ398,能夠促進PA囊胚率以及囊胚細胞數(shù),同時促進多能性相關(guān)基因以及與囊胚滋養(yǎng)層細胞發(fā)育潛力相關(guān)標志基因的表達,為下一步探討提高豬胚胎移植成功率奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The embryo divides from one omnipotent fertilized egg to form several blastomeres with almost the same developmental potential. As the shape of the embryo changes, a cavity is formed. At this time, the blastomere then differentiates into an inner cell mass (ICM), which then develops into the fetus and part of the placental tissue, and the trophoblast (T cell) in the outer layer. E), which later became part of the placenta, plays an important role in embryo implantation and pregnancy maintenance. Previous studies have shown that inhibiting the FGF signaling pathway in Buffalo blastocysts can increase the number of cells in the blastocyst * and the increase in cell numbers mainly comes from trophoblasts. In addition, studies in pigs also show that inhibition of FGF signaling pathway can not affect.TE. On the premise of normal embryo development and expression of related pluripotent genes, the expression level of trophoblast marker gene CDX2 can be significantly improved. However, the activation of FGF signaling pathway can significantly reduce the expression of CDX2. Although the mechanism is temporarily unknown, it may become a very promising research direction. * Few studies have been done on trophoblasts, and there is no criterion for measuring the development potential of trophoblasts in early embryos. The expression of CDX2, a trophoblast marker, is usually used as a criterion for trophoblastic cell development. A criterion for evaluating the development potential and increasing the number of cells and the expression of related markers/functional genes provide a very practical approach to improve the efficiency of subsequent embryo transfer. BGJ-398, a 5,10,15,20 Mu inhibitor of FGF signaling pathway, was cultured in basal medium for 168 hours to collect blastocysts. The blastocyst rate, the number of trophoblast cells and the expression of related genes were compared with DMSO control group. The results showed that: 1. BGJ-398 added to basal medium did not affect the formation and normal development of blastocysts, but with DMSO control group. Compared with the DMSO control group, the blastocyst rate of 5 mu M group increased significantly (29.64% vs 22.97%, P 0.05). The blastocyst rate of 10 mu M group increased slightly but the difference was not significant (24.68% vs 22.97%, P 0.05). When the concentration increased to 15 mu M, 20 mu M, the blastocyst rate decreased, indicating that excessive concentration inhibited the formation of blastocysts. Comparing with the control group, the number of blastocyst cells in 5_ M group was significantly increased (54.2 7.92 vs 45.16 8.75, P 0.05). The number of blastocyst cells in 10_ M group increased slightly but the difference was not significant (45.16 8.75 vs 48.2 4.32, P 0.05). The average number of blastocysts in 15_ M and 20_ M groups was lower than that in the control group. The results showed that compared with the control group, the expression of KLF4 was significantly increased by 6.28 times (P 0.05), while the expression of OCT4 was 1.50 times (P 0.05), and the expression of SOX2 was significantly increased by 3.45 times (P 0.05). The expression level of CDX2 gene was increased by 2.93 * (P0.05).2.BGJ398 significantly to promote the expression of the marker related genes of pig PA blastocyst trophoblast. By PCR detection, we found that GATA3, TEAD4, CCDX2, OCT4, TERT, OEMES, and OCT4 were expressed in blastocysts. These results suggest that GATA3, TEAD4, CDX2, OCT4, TERT, OEMES and FGFR2 can be used as evaluation genes for trophoblast cell detection in subsequent experiments. The expression of GATA3 in CDX2 upstream gene increased by 1.49 times and 2.14 times in 5 and 10 mu M groups respectively (P 0.05), but the difference was not significant; the expression of TERT in CDX2 upstream gene increased by 3.03 and 1.70 times compared with the control group (P 0.05); the expression of TEAD4 in CDX2 upstream regulatory factor also increased significantly, and the expression of TEAD4 in 5 mu M group increased significantly. The expression levels of FGFR2 were 2.00 and 2.09 times (P 0.05) as compared with the control group, and that of EOMES was 3.18 times (P 0.05) and 1.52 times (P 0.05) as compared with the control group. 3, the expression level of TEAD4 CDX2, OCT4, TERT and OEES increased significantly. It was speculated that BJG398 could enhance the developmental potential of trophoblastic cells and thus indirectly enhance the embryo implantation ability. * in conclusion, adding 5 MBGJ398 to pig embryo culture medium can promote the number of blastocysts and blastocyst cells, and promote pluripotent related genes and blastocyst nourishment. The expression of marker genes related to the development of cell * s layer lays the foundation for further discussion on the success rate of porcine embryo transfer.
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S828

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本文編號：2237058