【摘要】：碭山酥梨(Pyrus bretschneideri Rehd.cv.‘Dangshansuli’)在園藝學(xué)分類上介于白梨和砂梨之間,在我國安徽省碭山地區(qū)有著悠久的栽培歷史,是我國栽培面積最大的梨品種之一。近年來,在對碭山酥梨種質(zhì)資源的持續(xù)調(diào)查過程中,我們發(fā)現(xiàn)了一株酥梨的高糖芽變品系,該品系果實總糖含量顯著提高,甜度較高的果糖為主要糖組分,果實表面較非變異果實粗糙、皮孔密集、果銹重,而非變異果實為翠綠色,且變異性狀表現(xiàn)十分穩(wěn)定。課題組進(jìn)一步通過對變異果實和非變異果實的代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較研究發(fā)現(xiàn),在變異果實發(fā)育過程中,乙烯代謝發(fā)生顯著變化,推測與上游的兩個MADS轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控有關(guān)。為此,本論文對兩個MADS轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因克隆和功能分析,以驗證MADS對碭山酥梨果實發(fā)育過程中乙烯代謝的調(diào)控作用,為闡釋碭山酥梨高糖芽變果實糖積累的分子機(jī)制提供試驗依據(jù)。同時,有關(guān)果實成熟的研究多集中在呼吸躍變型果實上,對于非躍變型果實的成熟調(diào)控研究較少,因此,本論文對于揭示MADS轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非躍變型果實成熟機(jī)理研究也有著重要意義。本試驗以碭山酥梨的變異型和非變異型果實為試材,根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組和代謝組的整合分析結(jié)果,克隆2個MADS基因PbMADS12和PbMADS14,并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。采用實時定量PCR技術(shù),對PbMADS12和PbMADS14以及注釋為乙烯代謝相關(guān)功能基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。構(gòu)建超表達(dá)載體PC1301-MADS12和PC1301-MADS14,并成功轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄,并鑒定得到若干轉(zhuǎn)基因植株。本試驗取得以下主要結(jié)果:1.以采集的花后100 d(DPA100)變異和非變異果實為試材,克隆得到兩個MADS基因PbMADS12和PbMADS14;測序結(jié)果顯示,變異和非變異果實中克隆的PbMADS14基因序列相同,PbMADS12基因序列有一個堿基差異,翻譯出氨基酸序列無差異。PbMADS12的ORF框由720個堿基組成,編碼239個氨基酸,PbMADS14的ORF框由750個堿基組成,編碼249個氨基酸。結(jié)果表明,碭山酥梨的高糖芽變果實不是因為MADS基因的序列差異造成的。2.MADS基因進(jìn)行序列分析及進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,本試驗所克隆得到的兩個MADS基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的基因序列同源性較高,都含有兩個保守程度較高的結(jié)構(gòu)域MADS-box和K-box。3.對碭山酥梨轉(zhuǎn)錄組分析中注釋為乙烯代謝的相關(guān)功能基因以及PbMADS12和PbMADS14進(jìn)行了實時定量PCR分析,結(jié)果表明,非變異果實的供試基因表達(dá)量峰值均為花后130 d(DPA130),變異果實的供試基因表達(dá)量峰值均為花后160 d(DPA160)。4.成功構(gòu)建超表達(dá)載體PC1301-MADS12和PC1301-MADS14,轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄,分別以PbMADS12和PbMADS14基因和潮霉素基因序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,鑒定得到轉(zhuǎn)基因陽性番茄植株5個。
[Abstract]:Dangshan pear (Pyrus bretschneideri Rehd.cv.'Dangshansuli') is between white pear and sand pear in horticultural classification. It has a long cultivation history in Dangshan area of Anhui Province and is one of the largest pear varieties in China. In recent years, during the continuous investigation on the germplasm resources of Dangshanshu pear, we found a high sugar budding strain of Dangshanshu pear. The total sugar content of the fruit of this strain was significantly increased, and the fructose with high sweetness was the main sugar component. The surface of the fruit was rougher, the lenticels were dense, the fruit rust was heavy, but the non-variant fruit was emerald green, and the variation character was very stable. Through the comparative study of metabolomics and transcriptome of mutant fruit and non-variant fruit, it was found that ethylene metabolism changed significantly during the development of variant fruit, which was related to the regulation of two MADS transcription factors upstream. Therefore, two MADS transcription factors were cloned and analyzed in order to verify the role of MADS in regulating ethylene metabolism during fruit development of Dangshan pear. To provide experimental basis for explaining the molecular mechanism of sugar accumulation in high sugar budding fruit of Dangshan pear. At the same time, the researches on fruit ripening are mostly focused on the respiration type fruit, and there are few researches on the ripening regulation of non-climacteric fruit, so, This paper is also of great significance for the study of the mechanism of MADS transcription factors regulating the ripening of non-jumping fruits. In this experiment, two MADS genes, PbMADS12 and PbMADS14, were cloned from the mutant and non-variant fruits of Dangshanshu pear. According to the results of integrative analysis of transcriptional and metabolic groups, two MADS genes were cloned and analyzed by bioinformatics. The expression patterns of PbMADS12, PbMADS14 and genes related to ethylene metabolism were analyzed by real-time quantitative PCR. The superexpression vectors PC1301-MADS12 and PC1301-MADS14, were constructed and transformed into Micro-Tom tomato successfully, and some transgenic plants were identified. The main results of this experiment are as follows: 1. 1. Two MADS genes, PbMADS12 and PbMADS14;, were cloned from DPA100 and non-variant fruits collected after anthesis. The results showed that the sequence of PbMADS14 gene was the same as that of PbMADS12 gene, and there was a difference in the sequence of PbMADS12 gene between mutated and unmutated fruits. The ORF frame of PbMADS12 consists of 720 bases, and the ORF frame encoding 239 amino acids, PbMADS14, consists of 750 bases and encodes 249 amino acids. The results showed that the high sugar budding fruit of Dangshanshu pear was not caused by the sequence difference of MADS gene. 2. The results of sequence analysis and phylogenetic tree analysis of MADS gene showed that: 1. The two MADS gene sequences cloned in this study have high homology with those published in the NCBI database, and both contain two conserved domains, MADS-box and K-box.3. Real-time quantitative PCR analysis of functional genes related to ethylene metabolism and PbMADS12 and PbMADS14 in Dangshan pear transcriptome analysis was carried out. The peak value of gene expression in unmutated fruit was 130d after anthesis (DPA130), and the peak value of gene expression in mutant fruit was 160d after anthesis (DPA160) .4. The superexpression vector PC1301-MADS12 and PC1301-MADS14, were successfully constructed to transform Micro-Tom tomato. Five transgenic tomato plants were identified by PCR amplification with primers designed for PbMADS12 and PbMADS14 genes and hygromycin gene sequence, respectively.
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S661.2

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本文編號：2227802