【摘要】：三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我國特有的淡水育珠蚌,所產(chǎn)珍珠占珍珠總產(chǎn)量的80%。已有的研究表明,基質(zhì)蛋白在貝殼和珍珠的形成過程中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)基質(zhì)蛋白的研究大多都集中于海水貝類中,在淡水貝類中則相對較少。本實(shí)驗(yàn)從三角帆蚌貝殼珍珠層及外套膜組織中克隆得到了2個(gè)與珍珠層形成有關(guān)的基質(zhì)蛋白基因,并初步研究了其在珍珠和貝殼形成過程中的作用。1.從三角帆蚌貝殼珍珠層中分離得到了一個(gè)分子量大小為22kDa的基質(zhì)蛋白,根據(jù)N端測序結(jié)果和已知的基質(zhì)蛋白基因MSI60的氨基酸序列AAAAAAA分別設(shè)計(jì)簡并引物,從三角帆蚌外套膜中克隆得到了2個(gè)基質(zhì)蛋白基因的cDNA全長序列。其中hic22基因序列全長為731bp,包含一個(gè)621bp的開放閱讀框,編碼206個(gè)氨基酸;hic74基因全長2882bp,包含一個(gè)2553bp的開放閱讀框,編碼850個(gè)氨基酸,理論分子量為73.7kDa。Hic74的氨基酸組成中富含丙氨酸(30.8%),甘氨酸(25.8%)和絲氨酸(10.6%),在丙氨酸/甘氨酸富集區(qū)中,丙氨酸主要以poly A的形式存在,并存在3個(gè)酸性區(qū)域。組織熒光定量結(jié)果顯示,hic22和hic74基因在外套膜組織中特異性表達(dá),原位雜交結(jié)果顯示,hic22和hic74基因主要在外套膜的緣膜部上皮細(xì)胞表達(dá),推測基質(zhì)蛋白hic22和hic74參與了貝殼珍珠層的形成。2.在插片實(shí)驗(yàn)中,珍珠顆粒掃描電鏡結(jié)果顯示,珍珠的形成主要分為碳酸鈣晶體的無序沉積和有序沉積兩個(gè)階段。在規(guī)則珍珠層還未形成之前,碳酸鈣晶體無序地堆積在表面,而在珍珠層開始形成時(shí),碳酸鈣晶體首先在表面成核,然后開始有序的沉積。Hic22和hic74基因在珍珠囊形成和珍珠早期發(fā)育時(shí)期的熒光定量結(jié)果顯示,在碳酸鈣無序沉積階段,hic22和hic74基因在珍珠囊中的表達(dá)水平極低,而在珍珠成核期表達(dá)水平上升,在隨后珍珠層的快速生長和平穩(wěn)生長過程中,兩者的表達(dá)量呈逐步上升的趨勢。說明基質(zhì)蛋白hic22和hic74在指導(dǎo)碳酸鈣成核、調(diào)控珍珠層生長過程中發(fā)揮著重要作用。3.在破殼修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察中,貝殼先在破碎處形成角質(zhì)層,而后棱柱層晶體開始在角質(zhì)層的內(nèi)表面堆積并快速生長,當(dāng)棱柱層成熟后,珍珠層晶體開始在棱柱層堆積,且珍珠層的生長方式為典型的“磚墻型”。在貝殼修復(fù)的過程中,實(shí)驗(yàn)組中hic22基因表達(dá)量低于對照組,且呈逐步下降的趨勢,推測基質(zhì)蛋白hic22與其他基質(zhì)蛋白共同參與貝殼生物礦化過程。而hic74基因則在棱柱層快速生長期和珍珠層快速生長期高表達(dá),推測基質(zhì)蛋白hic74參與了三角帆蚌貝殼棱柱層和珍珠層的礦化。
[Abstract]:Hyriopsis cumingii (Hypriosis cumingii) is a special freshwater oyster in China, which produces 80% of the pearl. Previous studies have shown that matrix proteins play an important role in the formation of shells and pearls. Most of the studies on matrix proteins are concentrated in seawater shellfish, but relatively few in freshwater shellfish. In this study, two matrix protein genes related to the formation of pearl layer were cloned from the pearl layer and outer membrane tissue of Hyriopsis cumingii, and their roles in the formation of pearl and shell were preliminarily studied. A matrix protein with molecular weight of 22kDa was isolated from the pearl layer of Hyriopsis cumingii shell. Degenerate primers were designed based on N-terminal sequencing results and amino acid sequence AAAAAAA of known matrix protein gene MSI60. The full-length cDNA sequences of two matrix protein genes were cloned from the outer membrane of Hyriopsis cumingii. The total length of hic22 gene is 731 BP, which contains an open reading frame of 621bp, encoding a full length 2882bpof 206 amino acids, and an open reading frame of 2553bp encoding 850 amino acids. The amino acid composition with theoretical molecular weight of 73.7kDa.Hic74 is rich in alanine (30.8%), glycine (25.8%) and serine (10.6%). In the alanine / glycine rich region, alanine mainly exists in the form of poly A, and there are three acidic regions. The results of tissue fluorescence quantitative analysis showed the specific expression of Hech22 and hic74 genes in the outer membrane tissue, and in situ hybridization showed that the genes of Thic22 and hic74 were mainly expressed in the epithelial cells of the marginal membrane of the coat membrane. It is suggested that the matrix proteins hic22 and hic74 are involved in the formation of shell pearl layer. 2. The results of SEM show that the formation of pearls can be divided into two stages: disordered deposition and ordered deposition of calcium carbonate crystals. Before the regular pearl layer was formed, the calcium carbonate crystals piled up disorderly on the surface, and when the pearl layer began to form, the calcium carbonate crystals first nucleated on the surface. Then the fluorescence quantitative results of the sequence deposition of .Hic22 and hic74 genes during the formation of pearl sacs and the early development of pearls showed that the expression levels of Hic22 and hic74 genes in pearl sacs were very low during the disordered deposition of calcium carbonate. However, the expression level of pearls increased during nucleation, and then increased gradually during the rapid and steady growth of pearl layer. The results showed that the matrix proteins hic22 and hic74 played an important role in guiding the nucleation of calcium carbonate and regulating the growth of pearl layer. In the experimental observation of shell breaking and repairing, the shell first formed the cuticle at the broken place, then the prismatic layer crystal began to accumulate on the inner surface of the cuticle and grow rapidly. When the prism layer matured, the pearl layer crystal began to pile up in the prism layer. And the growth mode of pearl layer is typical "brick wall type". In the process of shell repair, the expression of hic22 gene in the experimental group was lower than that in the control group, and gradually decreased. It was speculated that the matrix protein hic22 and other matrix proteins were involved in the process of shell biomineralization. However, hic74 gene was highly expressed during the rapid growth of prisms and pearls, suggesting that the matrix protein hic74 was involved in the mineralization of shell prisms and nacreous layers of Hyriopsis cumingii.
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2209583