【摘要】：植物表皮蠟質(zhì)層作為植物與外界環(huán)境交替的最后一道自我防護(hù)的防線,對(duì)植物生存生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的生理及生態(tài)學(xué)功能,主要表現(xiàn)在植物抗旱性、抗病蟲害及抗射線等生物及非生物脅迫的防護(hù)機(jī)制中,并在水生植物向陸生植物進(jìn)化過(guò)程中起到了重要的意義。目前對(duì)植物表皮蠟質(zhì)的研究,主要圍繞其蠟質(zhì)生物合成代謝以及組成成分的研究中,如玉米、高粱、大麥、水稻、模式生物擬南芥以及苔蘚類植物中報(bào)道的蠟質(zhì)相關(guān)的研究；而對(duì)其在抗生物非生物脅迫機(jī)制,以及參與蠟質(zhì)生物合成代謝過(guò)程中基因功能的研究還不是很多；而克隆這些蠟質(zhì)相關(guān)基因是解釋整個(gè)蠟質(zhì)生物合成及抗性的關(guān)鍵。近年來(lái)隨著第二代測(cè)序技術(shù)的日臻成熟及重要作物基因組測(cè)序的完成,基因定位及克隆方法不斷改進(jìn)。本研究以玉米蠟質(zhì)生物合成代謝相關(guān)突變體glossy6為試材,構(gòu)建了F2代遺傳分離群體；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序BSR-Seq分析將glossy6定位在3號(hào)染色體113.5-146.7 Mb的區(qū)間內(nèi)；對(duì)至少6個(gè)等位的glossy6的Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體的Seq-Walking全基因組范圍Mu旁側(cè)序列檢測(cè)證明：glossy6, GRMZM2G139786(Chr3:127,513,712-127,514,561 bp),編碼一個(gè)DUF(Domain of Unknown Function)538蛋白,該基因由850個(gè)堿基的一個(gè)外顯子組成,編碼224個(gè)氨基酸的蛋白�；谝陨涎芯炕A(chǔ),本研究試圖從glossy6參與的可能的pathway來(lái)對(duì)其功能進(jìn)行解析,主要工作如下：1、glossy6和玉米中其他已經(jīng)克隆的及未克隆的glossy突變體相似,均表現(xiàn)出明顯的苗期葉片表皮蠟質(zhì)缺乏,且glossy6較其他突變體表型更明顯,表現(xiàn)為葉片翠綠發(fā)亮(而正常玉米葉片表面呈灰綠色,角質(zhì)層明顯覆蓋有一層蠟質(zhì))；在常溫下離體葉片失水速度較野生型快,證明其葉片通透性大于正常野生型。2、葉片表皮掃描電鏡SEM觀察表明glossy6突變體葉片表面蠟質(zhì)晶體明顯減少；投射掃描電鏡TEM觀察表明glossy6突變體細(xì)胞內(nèi)部具有針狀晶體存在,我們推測(cè)是由于細(xì)胞內(nèi)微粒體合成的脂類物質(zhì)未能正常運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外,進(jìn)而導(dǎo)致葉片表皮蠟質(zhì)減少(杜依聰工作)。3、基于BSR-Seq以及Seq-Walking的方法克隆了glossy6 (GRMZM2G139786),編碼一個(gè)未知功能的DUF538蛋白,同源進(jìn)化樹分析表明GLOSSY6在玉米中有一個(gè)相似度較高的同源旁系基因,其他禾本科作物中同源性較高,而在擬南芥等雙子葉植物中同源基因很少。4、基于蠟質(zhì)積累表型結(jié)果,我們對(duì)glossy6突變體及其對(duì)應(yīng)野生型苗期葉片表皮及角質(zhì)、以及微粒體蠟質(zhì)檢測(cè),GC-MS液相質(zhì)譜分析這幾部分組分中脂類物質(zhì)的成分及含量發(fā)現(xiàn)：玉米苗期(出苗后6-7天)葉表皮蠟質(zhì)主要以碳原子大于等于32的醛類和初級(jí)醇類組成；glossy6突變體相對(duì)于正常野生型苗期葉片表皮蠟質(zhì)含量明顯降低；主要表現(xiàn)為初級(jí)脂肪酸、初級(jí)烷烴、初級(jí)醛類、初級(jí)醇及蠟質(zhì)前體成分的降低,尤其是初級(jí)醇類和醛類降低比較明顯。微粒體蠟質(zhì)檢測(cè)結(jié)果表明突變體內(nèi)蠟質(zhì)較野生型積累,但積累程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于表皮蠟質(zhì)中的,因此可以肯定的說(shuō),gl6突變體較野生型表皮蠟質(zhì)減少而從某種程度上說(shuō),可能是glossy6突變體蠟質(zhì)運(yùn)輸?shù)酵饷娴纳倭?但也不排除其生物合成的蠟質(zhì)也是降低的。5、RNA-Seq差異表達(dá)基因結(jié)果分析表明,glossy6和正常野生型中均表達(dá)的24,426個(gè)基因中,glossy6相對(duì)于正常野生型53個(gè)顯著基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)表達(dá)(log2FC=-2; P value
[Abstract]:As the last self-defense line between plants and the external environment, plant epidermal wax layer has important physiological and ecological functions for plant survival and development. It is mainly manifested in plant drought resistance, disease and pest resistance, radiation resistance and other biological and abiotic stress protection mechanisms, and in the evolution of aquatic plants to terrestrial plants. Current studies on wax biosynthesis and its components in plant epidermis, such as maize, sorghum, barley, rice, model organism Arabidopsis and bryophytes, as well as the mechanisms of wax resistance to abiotic stress, and In recent years, with the development of second-generation sequencing technology and the completion of important crop genome sequencing, gene mapping and cloning methods have been improved. The F2 population was constructed from a mutant glossy 6 related to waxy biosynthesis and metabolism in maize; glossy 6 was located in the region of 113.5-146.7 Mb on chromosome 3 by transcriptome sequencing BSR-Seq analysis; Mu transposon insertion of mutant glossy 6 at least 6 alleles was sequenced in the Mu-Walking genome-wide side sequence. Detection showed that glossy 6, GRMZM2G139786 (Chr3:127,513,712-127,514,561 bp) encoded a DUF (Domain of Unknown Function) 538 protein, which was composed of an exon of 850 bases encoding a protein of 224 amino acids. Based on the above study, this study attempted to improve the function of glossy 6 through a possible pathway involving glossy 6. The main results were as follows: 1. Glossy 6 was similar to other cloned and uncloned glossy mutants in maize, and showed obvious wax deficiency in seedling leaf epidermis, and glossy 6 was more obvious than other mutant phenotypes, showing bright green leaves (while normal maize leaves showed gray green surface, cuticle covered with obvious). The dehydration rate of the isolated leaves was faster than that of the wild type at room temperature, indicating that the leaf permeability was higher than that of the normal wild type. It was speculated that the lipids synthesized by intracellular microsomes could not be transported out of the cell normally, which led to the reduction of leaf epidermal wax (Du Yicong works). 3 Glossy 6 (GRMZM2G139786) was cloned based on BSR-Seq and Seq-Walking methods, encoding an unknown function of DUF538 protein. Homologous evolutionary tree analysis showed that GLOSSY 6 was in maize. There is a homologous paragenic gene with high similarity. Other gramineous crops have high homology, but few homologous genes are found in dicotyledons such as Arabidopsis. Based on the results of wax accumulation phenotype, we detected the epidermis and keratin of glossy 6 mutant and its corresponding wild type seedlings, and microsomal wax, GC-MS liquid chromatography mass spectrometry. The results showed that the main components of leaf epidermal wax were aldehydes and primary alcohols with carbon atoms greater than or equal to 32 at seedling stage (6-7 days after seedling emergence); the content of leaf epidermal wax in glossy 6 mutant was significantly lower than that in normal wild type seedling stage; the main manifestations were primary fatty acids and primary alkanes. The decrease of hydrocarbons, primary aldehydes, primary alcohols and waxy precursors, especially primary alcohols and aldehydes, was more obvious. The results of microsomal wax test showed that the accumulation of wax in the mutant was much lower than that in the wild type, but the accumulation of wax in the epidermis was much lower than that in the epidermis wax. Therefore, it is certain that the gl6 mutant was less than that in the wild type epidermis wax and The results of RNA-Seq differential expression gene analysis showed that glossy 6 was significantly lower than that of the normal wild type in the expression of 24,426 genes. Expression (log2FC=-2; P value)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2207844