【摘要】：磷是植物的必要元素之一,缺磷使植物的生長(zhǎng)活動(dòng)受到影響。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是普遍存在于植物體內(nèi)的抗氧化劑,在植物抵抗低磷脅迫中起重要作用。GSH是植物細(xì)胞內(nèi)主要的還原性物質(zhì),其通過Asada-Halliwell的方式,有效清除植物生理生化活動(dòng)產(chǎn)生的過多的活性氧,保護(hù)植物體內(nèi)生物大分子物質(zhì)免受活性氧的傷害。GSH是在γ-谷氨酰半骯氨酸合成酶(γ-ECS)和谷胱甘肽合成酶(hGSHS)的催化作用完成的,y-ECS和hGSHS分別由γ-ECS和hGSHS基因編碼。y-ECS和hGSHS基因表達(dá)量、γ-ECS和hGSHS酶活水平、GSH的含量之間相互作用來有效應(yīng)對(duì)逆境脅迫。植物絡(luò)合素(Phytochelatins,PC)是以GSH為反應(yīng)底物合成的,PC可由外界重金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生,PC通過Cys上的硫基結(jié)構(gòu)與重金屬離子螯合以減少重金屬離子對(duì)植物的毒害作用。大豆中的GSH類物質(zhì)為谷胱丙肽(Homoglutataione,hGSH),hGSH幾乎具有GSH的所有功能;同樣大豆中的同源植物絡(luò)合素(Homophytochelatin,hPC)亦能實(shí)現(xiàn)PC的所有功能。篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因是實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)的先決條件。本實(shí)驗(yàn)以大豆耐低磷品種桂夏2號(hào)(GX2)和低磷敏感品種桂香1號(hào)(GX1)為材料,對(duì)大豆進(jìn)行1/5 Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液和低磷(0.2μmol/L KH2P04)處理,收集2 d、4d、8d、12d和16d根尖和葉片為材料,采用GeNorm分析法、NormFinder分析法、BestKeeper分析法、ACt對(duì)比分析法和RefFinder分析法分析低磷脅迫下15個(gè)內(nèi)參基因(18sRNA,ACT,ATP,CYP,Ef1-α,Ef1-β,G6PDH,PE,PP2A,PSC,TIF,TUB,UNK1,UNK2,Letin)的穩(wěn)定性,并選用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因計(jì)算不同磷脅迫時(shí)期γ-ECS和hGSHS的表達(dá)水平,同時(shí)運(yùn)用分光光度法研究了不同磷脅迫時(shí)期γ-ECS和hGSHS的酶活力水平,使用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)了低磷脅迫下hGSH和hPCs的含量變化。結(jié)果:在所有樣品組中最穩(wěn)定性最好是PSC、18sRN和和TUB,穩(wěn)定性排在最后的是PE和CYP;低磷實(shí)驗(yàn)組,穩(wěn)定性最好的是PP2A;空白組,ACT是最穩(wěn)定最好的內(nèi)參基因;葉片中顯示TIF穩(wěn)定性最好;根部顯示穩(wěn)定性最佳的是PE。根據(jù)TUB)計(jì)算y-ECS和hGSHS的相對(duì)表達(dá)量(Fold change,FC)。低磷脅迫下,GX1根部和葉部γ-ECS和hGSHS的相對(duì)表達(dá)量都隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)減少趨勢(shì);GX2根部γ-ECS和hGSHS的相對(duì)表達(dá)量都隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加;葉片中,γ-ECS的相對(duì)表達(dá)量亦呈現(xiàn)增加趨勢(shì),而hGSHS的相對(duì)表達(dá)量則減少;GX2的根部和葉部γ-ECS和hGSHS的酶活力都隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而上升,且根部上升的幅度要大于葉部,hGSH含量在GX2的根部和葉部也隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增加趨勢(shì);GX1中γ-ECS和hGSHS的酶活力和hGSH含量與GX2相比呈現(xiàn)相反趨勢(shì);hPCn(n=2～11)在低磷脅迫下大豆兩個(gè)品種中根和葉中的含量基本為零。本實(shí)驗(yàn)說明了 γ-ECS和hGSHS酶活水平提高、hGSH含量增加是大豆抵抗低磷脅迫的分子機(jī)制之一;γ-ECS和hGSH基因的與hGSH的合成存在相互調(diào)控的關(guān)系;谷胱丙肽合成酶基因表達(dá)差異可能是品種磷效率差異的原因。
[Abstract]:Phosphorus is one of the essential elements in plants. Phosphorus deficiency affects plant growth. Glutathione (Glutathione,GSH) is a common antioxidant in plants, which plays an important role in plant resistance to low phosphorus stress. Effectively scavenging excess reactive oxygen species from plant physiological and biochemical activities, Protection of Biomacromolecules from reactive oxygen species in plants. GSH was performed by the catalytic action of 緯 -glutamyl semidaminic acid synthase (緯 -ECS) and glutathione synthase (hGSHS), and hGSHS was encoded by 緯 -ECS and hGSHS genes. Y-ECS and hGSHS, respectively. The interaction between the level of 緯 -ECS and the level of hGSHS activity in response to stress was due to the expression of 緯 -ECS and the content of GSH. Plant complex hormone (Phytochelatins,PC) is synthesized by using GSH as the substrate. It can be induced by external heavy metal ions to produce PC. It chelates with heavy metal ions through the structure of sulfur group on Cys to reduce the toxic effect of heavy metal ions on plants. Glutathione (Homoglutataione,hGSH) hGSH has almost all the functions of GSH, and the homologous phytocomplexin (Homophytochelatin,hPC) in soybean can also perform all the functions of PC. Screening stable internal reference genes is a prerequisite for real-time quantitative PCR (Real-time quantitative PCR,RT-qPCR). In this experiment, soybean cultivar Guoxia 2 (GX2) and sensitive cultivar Guixiang 1 (GX1) were treated with 1 / 5 Hoagland total nutrient solution and 0. 2 渭 mol/L KH2P04 for 2 d, 4 d, 8 d, 12 d and 16 d, respectively. GeNorm analysis method was used to analyze the stability of 15 internal reference genes (18 s RNA-ACTT) CYPf1- 偽 Ef1- 尾 (G6PDHPEP), and the most stable internal reference genes were used to calculate the expression levels of 緯 -ECS and hGSHS in different phosphorus stress periods. The results showed that the stability of PP2An PSC-PSCTUBUNK1 and UNK2Letin was calculated by using the most stable internal reference gene under low phosphorus stress, and the stability of CYP1- 偽 Ef1- 偽 Ef1- 尾 (G6PDHP1- 尾) gene was calculated by using the most stable internal reference gene to calculate the expression level of 緯 -ECS and hGSHS in different phosphorus stress periods. At the same time, the enzyme activities of 緯 -ECS and hGSHS in different phosphorus stress periods were studied by spectrophotometry, and the changes of hGSH and hPCs contents under low phosphorus stress were detected by liquid-mass spectrometry. Results: among all the sample groups, the stability of PSC,18sRN and TUB, was the best, the stability of PE and CYP; was the lowest, the stability of PP2A; blank group was the most stable and the stability of PP2A; was the most stable and the stability of TIF was the best. The best indication of stability at the root is PE. The relative expression of y-ECS and hGSHS (Fold change,FC) was calculated according to TUB. Under low phosphorus stress, the relative expression of 緯 -ECS and hGSHS in roots and leaves of GX1 decreased with the prolongation of stress time. The relative expression of 緯 -ECS and hGSHS in root of GX2 increased with the prolongation of stress time. In leaves, the relative expression of 緯 -ECS also showed an increasing trend, while the relative expression of hGSHS decreased the activity of 緯 -ECS and hGSHS in roots and leaves of GX2 increased with the prolongation of stress time. The content of hGSH in the roots of GX2 increased with the prolongation of stress time. The activity of 緯 -ECS and hGSHS in GX1 and the content of hGSH in GX1 showed the opposite trend compared with that of GX2. The content of root and leaf in two soybean varieties was basically zero. The results showed that the increase of activity level of 緯 -ECS and hGSHS was one of the molecular mechanisms of soybean resistance to low phosphorus stress, and there was a mutual regulation between 緯 -ECS and hGSH genes and the synthesis of hGSH. The difference of glutathione synthase gene expression may be the reason for the difference of phosphorus efficiency.
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S565.1;Q943.2

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本文編號(hào)：2201516