發(fā)布時間：2018-08-21 12:02

【摘要】：杜鵑花科(Ericaceae)植物具極高的園藝價值,包括“十大名花”杜鵑花及藍莓等重要經(jīng)濟作物,是適應(yīng)貧瘠土壤的典型類群,研究認為這種適應(yīng)性與該科植物根系形成的一種特殊類型的內(nèi)生菌根：杜鵑花類菌根(也稱歐石楠類菌根,ERM)密切相關(guān)。為探討ERM共生體形成及效應(yīng)的分子機理,本研究從野生云錦杜鵑(Rhododendron fortunei Lindl.)根系中分離純化了一種ERM真菌,建立了該真菌與云錦杜鵑根系的共生體系,采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了接種苗根系在轉(zhuǎn)錄水平上的變化,獲得了大量與菌根形成及氮吸收代謝相關(guān)的差異表達基因。主要結(jié)果如下：(1)ERM真菌的鑒定真菌分離自浙江華頂山森林公園的野生云錦杜鵑根系,通過菌落、菌絲和孢子形態(tài)的觀察,以及ITS RNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析,確認該真菌為大孢樹粉孢原變種Oidodendron maius var. mains,編號為Om19。(2)ERM共生體系的建立通過真菌回接實驗,建立ERM共生體系。供試植物為云錦杜鵑種子播種于1/2 ER培養(yǎng)基生長兩個月的實生苗,供試真菌為Om 19；無菌條件下將實生苗移栽至基質(zhì)中,接種Om19菌塊,基質(zhì)為草炭與沙子按2：1體積比混合,并添加MMN營養(yǎng)液(氮源替換為硝態(tài)氮)；接種兩個月后采用錐蟲藍染色法觀察根系解剖結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)根系表皮和皮層細胞內(nèi)形成菌絲和菌絲節(jié),確認Om19與根系形成ERM共生體。接種苗株高、根長和根數(shù)顯著提高,表明ERM促進宿主植物對硝態(tài)氮的吸收。(3)ERM侵染進程的觀察及菌根侵染率的測定通過徒手壓片、掃描電鏡和半薄樹脂切片觀察接種Om19后每周根系的解剖形態(tài),追蹤侵染過程根系表面和細胞結(jié)構(gòu)的變化,并計算菌根侵染率。徒手壓片發(fā)現(xiàn)接種第二、三周的根系表面有菌絲及菌絲侵入點,第四周胞內(nèi)有菌絲和菌絲節(jié),第六周部分根段的細胞完全被侵染；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)接種苗根系表面包裹一層稠密的菌絲；半薄樹脂切片發(fā)現(xiàn)根系結(jié)構(gòu)簡單,沒有根毛結(jié)構(gòu),由1層表皮細胞和1-2層皮層細胞及狹小的中柱組成,90%以上含有菌絲的表皮細胞壁加厚不明顯；菌根侵染率在第二周逐漸上升,第六周顯著提高,達50%以上。(4)接種不同時期ERM促進云錦杜鵑生長效應(yīng)的觀察接種苗和未接種苗的鮮重從第一周到第十周都有不同程度的增長。第三周開始,接種苗的鮮重顯著高于未接種苗,從103.5mg增長到第十周的328.0mg,第六周接種苗的鮮重比未接種苗高63%,干重增加47%,植株總氮量提高36.6%。(5)轉(zhuǎn)錄組測序分析共生條件下云錦杜鵑根系基因表達由于接種第六周菌根侵染率、植株生物量和總氮含量均顯著提高,本研究構(gòu)建了該時期接種苗和未接種苗根系的轉(zhuǎn)錄組文庫,獲得70720條All-Unigene,分別在NR, NT, Swiss-Port, KEGG, COG和GO等六個數(shù)據(jù)庫中注釋到45058,36399,28048,4986,15106和35283條基因。通過FPKM法計算Unigene表達量,獲得了在接種苗根系中顯著差異表達的基因(DEGs)16892條,其中14364條顯著上調(diào)表達,4613條注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的267條代謝途徑中。(6)ERM形成及氮吸收代謝相關(guān)的途徑DEGs注釋結(jié)果中與菌根形成相關(guān)的代謝途徑有：內(nèi)吞作用411條,醚酯類代謝365條,植物病原菌互作237條,植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)223條,類結(jié)瘤因子信號途徑19條,鈣信號途徑21條。氮吸收代謝相關(guān)的代謝途徑有：代謝途徑注釋到1398條DEGs,氮代謝途徑32條,精氨酸與脯氨酸代謝途徑34條,礦物質(zhì)吸收代謝途徑23條。(7)與ERM形成及氮吸收代謝相關(guān)的基因DEGs中與叢枝菌根(AM)形成相關(guān)的同源基因有：ENOD 13條,SYMRK/NORK2條,CCaMK/DMI311條,NUP 16條,表明ERM的形成可能具有與AM類似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。DESs中與氮吸收和代謝相關(guān)的基因有：硝酸轉(zhuǎn)運蛋白基因(NRT)8條、氨轉(zhuǎn)運蛋白(AMT)11條,編碼谷氨酰胺合成酶俗氨酸合成酶(GS/GOGAT)代謝途徑中的關(guān)鍵基因有：硝酸還原酶(NR)4條、亞硝酸還原酶(NiR)4條,谷氨酸合成酶(GOGAT) 11條和谷氨酰胺合成酶(GS)3條。AMT基因的高表達表明ERM植物根系吸收硝態(tài)氮的途徑可能與AM相似,而NRT基因的上調(diào)表達表明ERM可能提高了根系對硝態(tài)氮的直接吸收能力。通過qRT-PCR技術(shù)分析了4條(SYMRK、NORK、CCaMK和DMI3)與ERM形成和7條(AMT3、NRT1-1、NRT1-2、GOGAT-1、GOGAT-2、GS-1和GS-2)與氮吸收代謝相關(guān)基因在接種不同時期的表達模式。結(jié)果顯示接種后這些基因表達量逐漸上升,在第六周表達量最高(除DMI3外),第八周下降,該現(xiàn)象與菌根侵染過程和效應(yīng)表達過程追蹤的實驗結(jié)果一致。
[Abstract]:Ericaceae plants have very high horticultural value, including the important cash crops such as "ten famous flowers" Rhododendron and blueberry. They are typical groups adapted to poor soil. It is considered that this adaptability is closely related to a special type of endophytic mycorrhizal formed by the roots of Ericaceae plants: Rhododendron mycorrhizal (also known as Photinia mycorrhizal, ERM). In order to explore the molecular mechanism of ERM symbiosis formation and its effect, an ERM fungus was isolated and purified from the roots of Rhododendron fortunei Lindl. The symbiotic system of the fungus and Rhododendron fortunei Lindl. was established. The changes of the root system at transcriptional level were analyzed by transcriptome sequencing. A large number of differentially expressed genes related to mycorrhizal formation and nitrogen uptake and metabolism were obtained. The main results were as follows: (1) ERM fungi were isolated from the roots of Rhododendron yunnanensis in Huadingshan Forest Park, Zhejiang Province. The fungi were identified as macrospores by morphological observation of colonies, hyphae and spores, and phylogenetic tree analysis of ITS RNA sequences. Establishment of symbiotic system of ERM by fungal inoculation experiment. The seedlings of Rhododendron yunnanensis were sown on 1/2 ER medium for two months, and the fungi were Om19. The seedlings were transplanted to the substrate under aseptic conditions and inoculated with Om19. The root anatomical structure was observed by trypanosome blue staining two months after inoculation. It was found that mycelia and hyphae nodes were formed in the epidermis and cortex cells of root system, and the ERM symbiosis was formed between Om19 and root system. (3) Observation of the infection process of ERM and determination of mycorrhizal infection rate were carried out by hand pressing, scanning electron microscopy and semi-thin resin section to observe the anatomical morphology of the root every week after inoculation of Om19, to track the changes of root surface and cell structure, and to calculate the mycorrhizal infection rate. Scanning electron microscopy showed that the root surface of inoculated seedlings was surrounded by a dense layer of hyphae; semi-thin resin section showed that the root structure was simple without root hairknot. The mycorrhizal infection rate increased gradually in the second week and increased significantly in the sixth week, reaching more than 50%. (4) The fresh weight of inoculated seedlings and uninoculated seedlings was observed. From the first week to the tenth week, the fresh weight of inoculated seedlings was significantly higher than that of non-inoculated seedlings, from 103.5mg to 328.0mg at the tenth week. The fresh weight of inoculated seedlings in the sixth week was 63% higher than that of non-inoculated seedlings, the dry weight increased by 47%, and the total nitrogen content increased by 36.6%. (5) Transcription sequence analysis of Rhododendron yunnanensis roots under symbiotic conditions. Because of the mycorrhizal infection rate at the sixth week of inoculation, plant biomass and total nitrogen content were significantly increased. A transcriptome Library of 70 720 All-Unigenes was constructed from the roots of inoculated and non-inoculated seedlings. These genes were annotated in NR, NT, Swiss-Port, KEGG, COG and GO databases to 45058, 36399, 28048, 4986, 15106, respectively. Unigene expression was calculated by FPKM method, and 16892 differentially expressed genes (DEGs) were obtained, of which 14364 were significantly up-regulated, and 4613 were annotated into 267 metabolic pathways in KEGG database. (6) DEGs related to ERM formation and nitrogen uptake and metabolism were related to mycorrhizal formation. There are 411 endocytosis pathways, 365 ether ester metabolism pathways, 237 plant pathogenic bacteria interactions, 223 plant hormone signaling pathways, 19 nodulation factor signaling pathways and 21 calcium signaling pathways. The metabolic pathways related to nitrogen uptake and metabolism include: the annotation of metabolic pathways to 1398 DEGs, 32 nitrogen metabolic pathways, and the metabolism of arginine and proline. There are 34 pathways and 23 pathways of mineral absorption and metabolism. The related genes are: nitrate transporter gene (NRT) 8, ammonia transporter protein (AMT) 11, encoding glutamine synthase vulgar acid synthase (GS / GOGAT) metabolic pathway of the key genes are: nitrate reductase (NR) 4, nitrite reductase (NiR) 4, glutamate synthase (GOGAT) 11 and glutamine synthase (GS) 3. High expression of ERM indicated that the pathway of nitrate uptake by roots of ERM plants might be similar to that of AM, and the up-regulation of NRT gene suggested that ERM might enhance the direct uptake of nitrate by roots. The formation of ERM and seven of ERM (AMT3, NRT1-1, NRT1-2, GOGAT-1, GS-1 and GS-2) were analyzed by qRT-PCR. The results showed that the expression of these genes increased gradually after inoculation, reached the highest level at the sixth week (except DMI3) and decreased at the eighth week, which was consistent with the experimental results of mycorrhizal infection and effector expression.
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S685.21

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本文編號：2195658