【摘要】：牛病毒性腹瀉／黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease, BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉／粘膜病病毒(BVDV)引發(fā)的牛的一種傳染病。該病主要發(fā)生于牛,犢牛更易感,還可感染其它動物,主要引起牛腹瀉,急、慢性粘膜病,持續(xù)性感染與免疫耐受,母畜流產(chǎn)和死胎等,給養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟造成嚴重的損失。為了調(diào)查寧夏地區(qū)牛病毒性腹瀉/粘膜病的流行病學及分子流行病學情況,掌握該病在寧夏地區(qū)的流行狀況,本試驗運用ELISA方法對寧夏BVDV的感染及流行情況進行調(diào)查。并在此基礎上對血清學陽性牛進行分子生物學跟蹤檢測,以獲得BVDV地方分離株。本研究對送到實驗室檢測的326份血清樣品和278份耳組織樣品,運用BVDV抗體ELISA檢測試劑盒對血清樣品進行抗體檢測,對耳組織樣品使用BVDV抗原ELISA檢測試劑盒進行抗原檢測。對送檢樣品BVDV血清學的研究。檢測結(jié)果顯示,326份血清樣品的BVDV抗體陽性率為90.2%,278份耳組織樣品的BVDV抗原陽性率為0.3%。檢測結(jié)果表明寧夏地區(qū)送檢的樣品中BVDV抗體陽性率很高,可能是因為送檢的都是具有腹瀉、流產(chǎn)等癥狀的樣品有關。利用細胞培養(yǎng)技術對診斷出的抗原陽牛進行病毒分離,并順利獲得牛病毒性腹瀉病毒分離株,命名為BVDV-NX。該分離株在MDBK細胞系上進行增殖培養(yǎng),出現(xiàn)空斑、拉網(wǎng)和脫落等一系列典型的細胞病變(CPE)。隨后收集病毒液,提取病毒總RNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得BVDV-NX毒株cDNA.利用PCR方法對5'-UTR基因片段進行擴增和測序,應用MEGA6分析軟件,選擇N-J(Neighbor-Joining)方法繪制遺傳進化樹,這株BVDV-NX屬于BVDV基因1b型。根據(jù)NCBI上已發(fā)表的BVDV-EO基因序列設計一對特異性引物,利用PCR方法擴增出710bp的E0基因,進行測序及序列分析。將PCR擴增的E0基因克隆入原核表達載體pET-32a,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)進行雙酶切鑒定,構建原核表達載體pET-32a-E0,為進一步的試驗奠定基礎。
[Abstract]:Bovine viral diarrhea / mucosal disease (BVD-MD) is an infectious disease caused by bovine viral diarrhea / mucosal disease virus (BVDV). The disease mainly occurs in cattle, calves are more susceptible to infection, but also can infect other animals, mainly causes bovine diarrhea, acute, chronic mucosal disease, persistent infection and immune tolerance, female abortion and stillbirth, and so on, causing serious economic losses to the cattle industry. In order to investigate the epidemiology and molecular epidemiology of bovine viral diarrhea / mucosal disease in Ningxia and to know the epidemic situation of the disease in Ningxia, the ELISA method was used to investigate the infection and prevalence of BVDV in Ningxia. On the basis of this, the seropositive cattle were tracked by molecular biology to obtain the local isolates of BVDV. In this study, 326 serum samples and 278 ear tissue samples sent to the laboratory were detected by BVDV antibody ELISA assay kit, and BVDV antigen ELISA kit was used to detect the antigen of ear tissue samples. Study on BVDV serology of sample. The results showed that the positive rate of BVDV antibody in 326 serum samples was 90.2and the positive rate of BVDV antigen in 278 ear tissue samples was 0.3%. The results showed that the positive rate of BVDV antibody was very high in the samples from Ningxia area, which may be related to the samples with diarrhea, abortion and other symptoms. Using cell culture technique, the virus was isolated from the diagnosed antigen, and the isolated strain of bovine viral diarrhea virus was successfully obtained, which was named BVDV-NX. The isolate was cultured on MDBK cell lines and showed a series of typical cytopathic (CPE)., such as plaque, mesh drawing and shedding. Then the virus solution was collected, the total RNA of the virus was extracted and the BVDV-NX strain cDNA was obtained by reverse transcription. The 5'-UTR gene fragment was amplified and sequenced by PCR method. N-J (Neighbor-Joining) method was selected to map the genetic evolution tree using MEGA6 analysis software. The BVDV-NX belongs to BVDV gene 1b type. According to the published sequence of BVDV-EO gene in NCBI, a pair of specific primers were designed. The E0 gene of 710bp was amplified by PCR method and sequenced. The E0 gene amplified by PCR was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) for double digestion to construct the prokaryotic expression vector pET-32a-E0, which laid a foundation for further experiments.
【學位授予單位】：寧夏大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

【相似文獻】

相關期刊論文 前6條

1 嚴偉行;;牛病毒性腹瀉病毒E0基因的原核表達與活性檢測[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年01期

2 王雪枝;朱遠茂;史鴻飛;嚴昊;蔡紅;王姝;馬磊;薛飛;;牛病毒性腹瀉病毒E0蛋白的表達與多克隆抗體制備[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2014年05期

3 李鵬;張淑琴;高維凡;溫永俊;;牛病毒性腹瀉病毒JL-1株E0基因的序列分析及其原核表達[J];中國獸醫(yī)科學;2014年04期

4 蔣祿峰;趙月蘭;李蘇楠;常麗云;張夢茜;包永占;秦建華;;牛病毒性腹瀉病毒HB-DCZ株E0基因的克隆與抗原表位預測[J];中國獸醫(yī)學報;2013年07期

5 白洪波,張進富,李巖松,周先榮,劉鳳英;原子核形狀演變的又一個特征指標E0躍遷及對~(10 2—110)Pd偶偶核的應用(英文)[J];高能物理與核物理;2004年03期

6 ;[J];;年期

相關重要報紙文章 前10條

1 本報記者 劉愛英;E0商標爭奪戰(zhàn)有望全面和解[N];中國知識產(chǎn)權報;2006年

2 佚名;E0“商標”事件各界專家有話要說[N];中國質(zhì)量報;2005年

3 本報記者　 汪 挺;E0商標事件凸顯中國NGO之困[N];中國商報;2006年

4 本報記者 周琪;EO商標挑戰(zhàn)E0行業(yè)標準[N];經(jīng)理日報;2005年

5 靜文;櫥柜使用“E0”板材≠環(huán)保[N];中國質(zhì)量報;2006年

6 方文;櫥柜環(huán)保與否不能單看E0[N];中國質(zhì)量報;2007年

7 本報實習記者　 趙志國;櫥柜:從"顏色革命"到"E0風暴"[N];中華建筑報;2006年

8 俞晶;E0風暴從地板刮到櫥柜[N];消費日報;2006年

9 孫斌斌;柯諾歐家E0地板挑戰(zhàn)環(huán)保極限[N];中國質(zhì)量報;2005年

10 新民;裝潢板材“超E0”究竟靈不靈[N];中國建設報;2006年

相關碩士學位論文 前8條

1 趙世媛;牛病毒性腹瀉病毒寧夏地方分離株的分離及其E0基因原核表達載體的構建[D];寧夏大學;2016年

2 蔣祿峰;牛病毒性腹瀉病毒E0基因重組乳酸菌的制備及其免疫效果檢測[D];河北農(nóng)業(yè)大學;2013年

3 步顯哲;相互作用玻色子模型U(5)?O(6)過渡區(qū)的E0躍遷研究[D];遼寧師范大學;2014年

4 王璐;牛病毒性腹瀉病毒E0基因的表達及間接ELISA檢測方法的建立[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2012年

5 王雪枝;牛病毒性腹瀉病毒E0蛋白單抗與多抗制備及實驗感染小鼠的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

6 孔鵬;豬瘟地方流行株（BJCY/96）的全長ORF測序及E0基因的分段表達[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2006年

7 張磊;中國部分省區(qū)豬瘟E0基因的分子流行病學研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2007年

8 石明;牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒E0、E2基因免疫原性的比較[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2014年

，

本文編號：2193542