【摘要】：【目的】探究GPNMB是否會(huì)通過調(diào)控MITF及其下游色素相關(guān)基因的表達(dá)來影響黑色素細(xì)胞中色素的生成,為進(jìn)一步闡明GPNMB對(duì)黑色素細(xì)胞中色素生成的具體機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】首先對(duì)小鼠GPNMB核酸序列進(jìn)行檢索,通過對(duì)GPNMB和慢病毒表達(dá)載體序列分析來篩選出合適的酶切位點(diǎn),在此選取SalⅠ和XbaⅠ作為酶切位點(diǎn)。并對(duì)GPNMB基因序列設(shè)計(jì)含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)引物,克隆GPNMB基因全長(zhǎng)序列,將含有酶切位點(diǎn)的GPNMB基因片段與T載體進(jìn)行連接,送華大基因測(cè)序。將構(gòu)建成功的T載體提取質(zhì)粒,雙酶切后將其與含有綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒表達(dá)載體相連接,送華大基因進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)。使用質(zhì)粒中提試劑盒獲得大量去內(nèi)毒素的GPNMB慢病毒真核表達(dá)載體。通過體外培養(yǎng)小鼠黑色素細(xì)胞,選擇細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過量表達(dá)GPNMB。觀察轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞形態(tài)特征變化和綠色熒光蛋白的表達(dá)量,收集黑色素細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證,黑色素含量進(jìn)行測(cè)定,以及經(jīng)Real-time PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表達(dá)量�！窘Y(jié)果】與正常組(Control)相比試驗(yàn)組(Vector-GFP-GPNMB)、空載組(Vector-GFP)中黑色素細(xì)胞的形態(tài)特征無明顯變化,并且試驗(yàn)組、空載組的綠色熒光蛋白表達(dá)量顯示5μg DNA/孔轉(zhuǎn)染效率最高。相對(duì)于空載組和正常組,試驗(yàn)組的GPNMB mRNA和蛋白水平都顯著的升高(P0.01)。與空載組相比,試驗(yàn)組黑色素含量升高1.34倍,差異顯著(P0.01)。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,MITF mRNA顯著降低2.25倍(P0.01);PMEL mRNA顯著升高1.59倍(P0.05);TYRP1 mRNA顯著升高2.35倍(P0.01);TYRP2 mRNA顯著升高1.60倍(P0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但變化不明顯。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,MITF蛋白顯著降低1.59倍(P0.01);TYR蛋白顯著升高1.23倍(P0.01);TYRP2蛋白顯著升高4.35倍(P0.01);OA1蛋白顯著升高1.31倍(P0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但變化不明顯�！窘Y(jié)論】GPNMB過量表達(dá)使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表達(dá)量增加,卻使MITF的表達(dá)量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF調(diào)控路徑調(diào)節(jié)PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表達(dá),從而影響黑色素的生成。
[Abstract]:[objective] to investigate whether GPNMB affects melanocyte pigment production by regulating the expression of MITF and its downstream pigment related genes. In order to further elucidate the specific mechanism of melanocyte pigment formation by GPNMB. [methods] the nucleic acid sequence of mouse GPNMB was searched first, and the suitable restriction site was screened by analyzing the sequence of GPNMB and lentivirus expression vector. Sal 鈪，

本文編號(hào)：2186844