【摘要】：【目的】探究GPNMB是否會通過調(diào)控MITF及其下游色素相關(guān)基因的表達來影響黑色素細胞中色素的生成,為進一步闡明GPNMB對黑色素細胞中色素生成的具體機制提供理論依據(jù)�！痉椒ā渴紫葘π∈驡PNMB核酸序列進行檢索,通過對GPNMB和慢病毒表達載體序列分析來篩選出合適的酶切位點,在此選取SalⅠ和XbaⅠ作為酶切位點。并對GPNMB基因序列設計含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位點的全長引物,克隆GPNMB基因全長序列,將含有酶切位點的GPNMB基因片段與T載體進行連接,送華大基因測序。將構(gòu)建成功的T載體提取質(zhì)粒,雙酶切后將其與含有綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒表達載體相連接,送華大基因進一步測序確認。使用質(zhì)粒中提試劑盒獲得大量去內(nèi)毒素的GPNMB慢病毒真核表達載體。通過體外培養(yǎng)小鼠黑色素細胞,選擇細胞對數(shù)生長期利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過量表達GPNMB。觀察轉(zhuǎn)染后黑色素細胞形態(tài)特征變化和綠色熒光蛋白的表達量,收集黑色素細胞,并對其進行轉(zhuǎn)染效率驗證,黑色素含量進行測定,以及經(jīng)Real-time PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表達量�！窘Y(jié)果】與正常組(Control)相比試驗組(Vector-GFP-GPNMB)、空載組(Vector-GFP)中黑色素細胞的形態(tài)特征無明顯變化,并且試驗組、空載組的綠色熒光蛋白表達量顯示5μg DNA/孔轉(zhuǎn)染效率最高。相對于空載組和正常組,試驗組的GPNMB mRNA和蛋白水平都顯著的升高(P0.01)。與空載組相比,試驗組黑色素含量升高1.34倍,差異顯著(P0.01)。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,MITF mRNA顯著降低2.25倍(P0.01);PMEL mRNA顯著升高1.59倍(P0.05);TYRP1 mRNA顯著升高2.35倍(P0.01);TYRP2 mRNA顯著升高1.60倍(P0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但變化不明顯。Western blot檢測結(jié)果顯示,MITF蛋白顯著降低1.59倍(P0.01);TYR蛋白顯著升高1.23倍(P0.01);TYRP2蛋白顯著升高4.35倍(P0.01);OA1蛋白顯著升高1.31倍(P0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但變化不明顯。【結(jié)論】GPNMB過量表達使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表達量增加,卻使MITF的表達量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF調(diào)控路徑調(diào)節(jié)PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表達,從而影響黑色素的生成。
[Abstract]:[objective] to investigate whether GPNMB affects melanocyte pigment production by regulating the expression of MITF and its downstream pigment related genes. In order to further elucidate the specific mechanism of melanocyte pigment formation by GPNMB. [methods] the nucleic acid sequence of mouse GPNMB was searched first, and the suitable restriction site was screened by analyzing the sequence of GPNMB and lentivirus expression vector. Sal 鈪，

本文編號：2186844