【摘要】：研究背景近年來,隨著對腫瘤發(fā)病機制的深入研究,人們認識到腫瘤的發(fā)生不僅取決于基因自身的異常,還與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控的紊亂密切相關(guān)。進一步的研究還發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)特異性組蛋白修飾酶的表達情況又影響著相關(guān)組蛋白的修飾水平,其異常表達與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。組蛋白去乙�；敢种苿㈱olinza和Istodax作為抗腫瘤藥物在美國上市,也從另一個角度證明了這一點。目前正有越來越多的研究開始關(guān)注與基因表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)的組蛋白修飾酶的功能,希望尋找到潛在的抗腫瘤藥物作用靶點,進而干預腫瘤細胞的生長。在這眾多的組蛋白修飾酶中,哺乳動物組蛋白H3賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶(又稱為KMT2酶)引起了很多研究者的關(guān)注。因為腫瘤基因圖譜計劃通過對人類腫瘤進行測序,指出KMT2家族的疾病相關(guān)特異性基因異常與乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌等多種腫瘤密切相關(guān)。對KMT2酶的研究,目前主要有兩大思路。一是根據(jù)KMT2分為MLL1-4和SETIA/IB等幾個不同亞型的研究結(jié)論,通過敲除不同的亞型研究每個亞型的KMT2的功能。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),每一個KMT2亞型的功能都有其基因特異性,任一亞型的缺失都會導致小鼠出現(xiàn)嚴重的表現(xiàn)型。Mill-/-小鼠在胚胎發(fā)育階段死亡,Mill-/-小鼠生長遲緩同時伴有造血系統(tǒng)的異常。還有許多研究證實MLL1蛋白的缺失與許多類型的人類白血病的發(fā)病相關(guān)。Mll2-/-小鼠胚胎發(fā)育緩慢,凋亡增加,常于胚胎發(fā)育的第10.5天死亡。另外,條件性敲除卵細胞的Mll2基因會導致排卵的中止和卵細胞的死亡；條件性敲除雄鼠生殖細胞的Mll2會導致雄鼠的不育。Setla-/-和Setlb-/-小鼠分別于胚胎發(fā)育的第5.5天和第11.5天死亡。二是根據(jù)KMT2酶含有包括WDR5、RbBP5、ASH2L和DPY30等核心蛋白的研究結(jié)論,通過敲除不同蛋白的方式研究每種核心蛋白和KMT2的功能,如ASH2L蛋白的缺失可導致KMT2酶催化活性的降低。由于敲除KMT2亞型的研究方法,無法排除敲除某一亞型后其他亞型的補償作用,目前越來越多的研究傾向于運用敲除某一核心蛋白的方式研究KMT2的功能。已有的研究認為,敲除靶細胞內(nèi)ASH2L基因所引起的H3K4me3修飾的下降不能被其他途徑所代償。關(guān)于ASH2L的研究,目前已經(jīng)在其結(jié)構(gòu)及功能兩方面取得明顯進展。在結(jié)構(gòu)方面的研究,Ikegawa等于1999年成功克隆出了完整的人類ASH2L基因cDNA序列。人類ASH2L基因位于8號染色體,其基因組DNA長度跨越34 kb。迄今已被發(fā)現(xiàn)有3種剪接異構(gòu)體,其中1型為最經(jīng)典的亞型,由628個氨基酸組成,包含16個外顯子,cDNA長2368 bp。對ASH2L1的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其含有5個結(jié)構(gòu)域,即N端的PHD和HWH結(jié)構(gòu)域、中部的NLS核定位序列及C端的SPRY和SDI結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)特點與ASH2L在細胞中的定位、蛋白間的相互作用及調(diào)控細胞的生物學行為密切相關(guān)。在功能研究方面,出于醫(yī)學倫理的考慮及小鼠Ash21蛋白與人ASH2L蛋白具有高度同源性,目前絕大多數(shù)對ASH2L蛋白功能的研究都是以小鼠為研究對象。研究已發(fā)現(xiàn),Ash2l-/-小鼠死于胚胎發(fā)育期；Ash21對維持胚胎干細胞(ES)的多向分化潛能及維持染色質(zhì)的開放狀態(tài)具有重要的作用；Ash21也可能參與到炎癥反應、心肌肥大及肺動脈高壓等疾病的發(fā)病過程中。本課題組的前期研究還發(fā)現(xiàn),ASH2L蛋白與癌蛋白MYC相互作用；在人類乳腺癌等多種腫瘤組織中表達升高；能夠與活化的Ha-RAS協(xié)同促進原代大鼠胚胎成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。由此可以推斷：ASH2L極有可能作為癌基因發(fā)揮作用。本課題組在前期研究中試圖在小鼠肝細胞內(nèi)特異性地過表達ASH2L論證上述推測,但很遺憾該推測未能被證實。小鼠肝細胞內(nèi)ASH2L的過表達并不能夠誘發(fā)自發(fā)性肝癌或促進二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌。過表達ASH2L不會影響肝細胞的生長、引起肝功能損害和肝臟組織學的改變。綜上所述,既往的研究已經(jīng)證明了ASH2L蛋白可以通過影響KMT2酶的活性而影響組蛋白修飾等基因的表觀遺傳調(diào)控。在ASH2L功能研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在維持ES細胞多向分化潛能及胚胎發(fā)育等方面的作用,但具體到ASH2L與癌癥的關(guān)系上卻面臨著困境。本課題組前期實驗試圖利用ASH2L的過表達方式研究其在肝癌發(fā)生中的作用但未獲成功。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)換研究角度,不再通過ASH2L過表達的方式研究ASH2L的功能,而是通過敲除Ash2l方式反向推導Ash21蛋白的功能,這為深入研究ASH2L的功能奠定基礎(chǔ)。研究目的1.構(gòu)建條件性基因敲除動物模型,研究敲除Ash2l對小鼠肝臟及個體發(fā)育的影響。2.在小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)中條件性地敲除Ash2l,研究其對細胞生理功能的影響,并探討其可能的機制。研究方法一、將基因型為Ash2lfl/fl的小鼠與Ash2l+/+Tg(AlbCre)的小鼠交配,得到子代Ash2l+/flTg(AlbCre)小鼠,讓其后代繼續(xù)交配,獲得實驗組Ash2l敲除(Ash2l KO)小鼠Ash2lf/flTg(AlbCre)及不同基因型的對照組小鼠(Ash2lfl/fl, Ash2l+/fl, Ash2l+/flTg(AlbCre), Ash2l+/+, Ash2l+/+Tg(AlbCre))。所獲小鼠進行以下實驗：1.每天觀測小鼠的體重、一般情況、日常行為及臨床監(jiān)測指標等,并且給予評分,當實驗組小鼠評分超過20分時終止實驗。2. 處死小鼠前,稱重小鼠并用毛細玻璃管從小鼠眼內(nèi)眥眼眶后靜脈叢取血。分離獲得血清,進行堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及總膽紅素(TBIL)等與肝功能相關(guān)的酶學檢測。3.采用PCR方法檢測Ash2l在DNA和RNA水平上的敲除效率。4.采用Western blot方法檢測蛋白水平上Ash21的表達情況。5.采用HE、PAS、Gomori染色等方法評價敲除Ash2l后肝臟組織學變化。6.采用免疫組織化學方法對小鼠肝臟組織切片進行染色,分析Ash21、H3K4me3、Ki67和γH2A.X等的含量。7.小鼠肝組織切片TUNEL染色及cleaved caspase-3免疫組織化學染色檢測肝細胞凋亡的情況。二、將基因型為Ash2lfl/fl的小鼠與Ash2l+/+Tg(CAGCreERT2)的小鼠交配,讓其后代繼續(xù)交配,從孕13.5天的雌鼠體內(nèi)篩選基因型為Ash2l+/+Tg(CAG-CreERT2)和Ash2lfl/flTg(CAGCreERT2)的小鼠胚胎,制備原代小鼠胚胎成纖維細胞(pMEFs)。采用磷酸鈣瞬時轉(zhuǎn)染的方法將含有p19ARF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細胞Plat-E,并收集生成的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染pMEFs。被病毒感染的pMEFs再經(jīng)過相應抗生素篩選2周,獲得永生化小鼠胚胎成纖維細胞(iMEFs)。所制備的pMEFs和iMEFs于對數(shù)生長期內(nèi)進行以下實驗：1.采用PCR和Western blot的方法分別檢測Ash2l在DNA水平上的敲除效率和蛋白水平上的表達情況。2.通過繪制細胞生長曲線及亞甲藍染色方法監(jiān)測細胞的生長情況。3.采用PI染色結(jié)合流式細胞技術(shù)研究細胞周期的分布。4.采用Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡。5.采用β-半乳糖苷酶染色方法檢測細胞衰老。6.采用Western blot和免疫熒光染色方法檢測細胞總體和單個細胞內(nèi)Ash21、H3K4me3和γH2A.X的含量。7.采用Western blot方法檢測敲除Ash2l可能引起的iMEFs內(nèi)組蛋白修飾的改變。研究結(jié)果一、敲除Ash2l引起小鼠肝臟損傷。經(jīng)過在DNA、RNA及蛋白水平上對Ash2l敲除效率的驗證,成功構(gòu)建了肝細胞特異性基因敲除小鼠模型。Ash2l KO小鼠形體較小,生長遲緩,活動減少。在終止實驗前,6只Ash2l KO小鼠死亡,平均死亡年齡26.17±9.19天。與對照組相比,存活的雌性和雄性Ash2l KO小鼠的體重均明顯下降(雌鼠：7.45±2.36 g(KO)vs.11.19±4.61 g(C),P0.05；雄鼠：6.56±1.05g(KO)vs.8.06±1.84 g(C),P0.05)血清酶學檢測顯示：Ash2l KO小鼠較對照組小鼠的ALP、ALT、AST水平明顯升高(ALP:2022.20±195.70 U/L(KO)vs.467.05±52.01 U/L(C), P0.001;ALT:110.68±17.77 U/L(KO)vs.49.96±6.70 U/L(C),P0.001; AST:248.34±37.75 U/L(KO)vs.104.31±17.52 U/L(C),P0.001); TBIL水平也有所升高,但差異不具有統(tǒng)計學意義(48.26±12.33 μmol/L(KO)vs.17.90±10.42 μmol/L(C),P=0.070)小鼠肝臟的組織學分析顯示,Ash2l KO小鼠肝細胞內(nèi)Ash21蛋白表達下降同時伴有H3K4me3的缺失,但在肝臟其他類型的細胞中,仍可見Ash21蛋白及H3K4me3的存在,如Kupffer細胞和內(nèi)皮細胞等。小鼠肝組織切片HE染色顯示,不同基因型對照組小鼠的肝細胞形態(tài)學一致,未見明顯異常,而Ash2l KO小鼠肝細胞脹大,胞漿呈疏松態(tài),出現(xiàn)氣球樣變,并伴有羽毛狀變性。且隨著小鼠天齡的增加,Ash2l KO小鼠肝臟的膽管反應明顯。PAS染色顯示其含有蠟樣質(zhì)的巨噬細胞增多,改良的Gomori染色顯示其部分區(qū)域內(nèi)肝細胞塌陷,門靜脈橋接纖維化。在超過11天齡的小鼠肝臟細胞中,敲除Ash2l可以引起Ki67升高,肝細胞核變大、深染。此外,Ash2l KO和對照組小鼠的肝細胞在cleaved caspase-3和TUNEL染色上無明顯差異,在部分Ash2l KO小鼠肝細胞中γH2A.X升高。二、敲除Ash2l抑制細胞增殖。經(jīng)過在DNA及蛋白水平上對Ash2l敲除效率的驗證,成功建立了可誘導Ash2l敲除的MEFs.細胞生長曲線及亞甲藍染色結(jié)果顯示,敲除Ash2l可抑制MEFs的增殖。細胞周期分析結(jié)果顯示,Ash2l KO pMEFs明顯阻滯于G0/G1期,同時伴有S期細胞比例的明顯下降。運用流式細胞技術(shù)檢測經(jīng)AnnexinV-FITC/PI染色的Ash2l KO MEFs的凋亡情況時發(fā)現(xiàn)：在干擾Ash21表達7天后,與對照組相比,iAsh2lfl/flMEFs在FSC和SSC軸上分布彌散,細胞凋亡顯著增加(AnnexinV+:18.19±1.15% (+HOT)vs.7.55士1.49%(-HOT),P0.05:AnnexinV+PI-:10.38±0.49% (+HOT)vs.0.92±0.07%(-HOT),P0.001),而HOT的誘導并不能促進iAsh2l+/+ MEFs的凋亡(AnnexinV+:11.01±0.27%(+HOT)vs.11.92± 1.33%(-HOT),P=0.359:AnnexinV+PI-:2.14±0.17%(+HOT)vs.2.25 ±0.49%(-HOT),P=0.739).與iMEFs細胞凋亡檢測結(jié)果一致,經(jīng)過HOT誘導7天后,pAsh2lfl/flMEFs與對照組相比,凋亡細胞和早期凋亡細胞的比例均顯著升高(AnnexinV+:34.13±0.85%(+HOT)vs.22.93±0.37% (-HOT),P0.001:AnnexinV+PI-:22.30±0.95%(+HOT)vs.13.00± 0.50%(一HOT),P0.001),pAsh2l+/+MEFs在經(jīng)過HOT處理后與對照組相比無明顯差異(AnnexinV+:24.62±1.72%(+HOT)vs.26.87±1.42%(-HOT),P=0.157:AnnexinV+PI-:13.60±0.46%(+HOT)vs.14.10±1.21%(-HOT),P=0.541)。此外,收集懸浮細胞進行細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn),iAsh2lfl/flMEFs在經(jīng)過HOT誘導處理7天后有63.90±0.61%的懸浮細胞處于早期凋亡階段。對照組iAsh2lfl/flMEFs(±HOT)及iAsh2lfl/flMEFs(-HOT)由于懸浮細胞極少,無法收集到足夠的細胞用于凋亡檢測。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),iAsh2l KO MEFs形態(tài)不規(guī)則,體積增大、扁平,細胞核變大。β.半乳糖苷酶染色顯示,iAsh2lfl/flMEFs和iAsh2lfl/fl在經(jīng)過HOT誘導5天后,p-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例與未經(jīng)HOT處理的對照組相比顯著升高(iAsh2lfl/fl:65.04±4.35%(+HOT)vs.1.24±0.62%(-HOT), P0.001:iAsh2lfl/fl:72.19±3.17%(+HOT)vs.2.58±0.49%(-HOT), P0.001).iAsh2l+/+MEFs在經(jīng)過HOT處理后,陽性細胞比例也明顯升高,但均低于3%(iAsh2l+/+:2.59±1.01%(+HOT)vs.0.95±0.05%(-HOT), P=0.048:iAsh2l+/+:1.88±0.19%(+HOT)v.0.86±0.11%(-HOT),P =0.001).Western blot顯示iAsh2l KO iMEFs內(nèi)總體yH2A.X的含量升高,免疫熒光檢測顯示部分Ash21缺失的iMEFs內(nèi)γH2A.X含量升高。采用Western blot方法檢測敲除Ash2l后iMEFs內(nèi)組蛋白修飾的改變,發(fā)現(xiàn)干擾Ash21表達后H3K4mel/me2/me3修飾水平下降,而對其他組蛋白翻譯后修飾如H3K9ac、H3K9me3、H3K27ac和H3K27me3等沒有影響。免疫熒光檢測顯示在Ash21缺失的iMEFs內(nèi)H3K4me3的修飾也隨之消失。結(jié)論1.成功構(gòu)建的肝細胞特異性基因敲除動物模型證明,敲除Ash2l基因?qū)е滦∈蟪錾蟾闻K功能受損、個體發(fā)育遲緩甚至死亡。2.Ash2l KO小鼠肝臟組織學的改變可能是由Ash21蛋白缺失引起的H3K4me3修飾異常所致。3.成功構(gòu)建的可誘導條件性基因敲除MEFs證明,敲除Ash2l基因可以抑制細胞的增殖。4.Ash21蛋白缺失引發(fā)的細胞生長受抑可能是通過促進細胞衰老及一定程度上的細胞凋亡而形成的。研究意義1.首次建立了肝細胞特異性Ash21敲除動物模型,證明了Ash21基因?qū)S持正常肝臟功能及個體發(fā)育具有重要意義。2.進一步研究并證明了Ash21基因?qū)毎鲋车淖饔谩?.為ASH2L基因作為潛在的癌基因治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R73-3
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本文編號：2178598