【摘要】：研究背景近年來(lái),隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究,人們認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生不僅取決于基因自身的異常,還與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控的紊亂密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)特異性組蛋白修飾酶的表達(dá)情況又影響著相關(guān)組蛋白的修飾水平,其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。組蛋白去乙�；敢种苿㈱olinza和Istodax作為抗腫瘤藥物在美國(guó)上市,也從另一個(gè)角度證明了這一點(diǎn)。目前正有越來(lái)越多的研究開始關(guān)注與基因表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)的組蛋白修飾酶的功能,希望尋找到潛在的抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn),進(jìn)而干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在這眾多的組蛋白修飾酶中,哺乳動(dòng)物組蛋白H3賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶(又稱為KMT2酶)引起了很多研究者的關(guān)注。因?yàn)槟[瘤基因圖譜計(jì)劃通過對(duì)人類腫瘤進(jìn)行測(cè)序,指出KMT2家族的疾病相關(guān)特異性基因異常與乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌等多種腫瘤密切相關(guān)。對(duì)KMT2酶的研究,目前主要有兩大思路。一是根據(jù)KMT2分為MLL1-4和SETIA/IB等幾個(gè)不同亞型的研究結(jié)論,通過敲除不同的亞型研究每個(gè)亞型的KMT2的功能。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),每一個(gè)KMT2亞型的功能都有其基因特異性,任一亞型的缺失都會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的表現(xiàn)型。Mill-/-小鼠在胚胎發(fā)育階段死亡,Mill-/-小鼠生長(zhǎng)遲緩?fù)瑫r(shí)伴有造血系統(tǒng)的異常。還有許多研究證實(shí)MLL1蛋白的缺失與許多類型的人類白血病的發(fā)病相關(guān)。Mll2-/-小鼠胚胎發(fā)育緩慢,凋亡增加,常于胚胎發(fā)育的第10.5天死亡。另外,條件性敲除卵細(xì)胞的Mll2基因會(huì)導(dǎo)致排卵的中止和卵細(xì)胞的死亡；條件性敲除雄鼠生殖細(xì)胞的Mll2會(huì)導(dǎo)致雄鼠的不育。Setla-/-和Setlb-/-小鼠分別于胚胎發(fā)育的第5.5天和第11.5天死亡。二是根據(jù)KMT2酶含有包括WDR5、RbBP5、ASH2L和DPY30等核心蛋白的研究結(jié)論,通過敲除不同蛋白的方式研究每種核心蛋白和KMT2的功能,如ASH2L蛋白的缺失可導(dǎo)致KMT2酶催化活性的降低。由于敲除KMT2亞型的研究方法,無(wú)法排除敲除某一亞型后其他亞型的補(bǔ)償作用,目前越來(lái)越多的研究?jī)A向于運(yùn)用敲除某一核心蛋白的方式研究KMT2的功能。已有的研究認(rèn)為,敲除靶細(xì)胞內(nèi)ASH2L基因所引起的H3K4me3修飾的下降不能被其他途徑所代償。關(guān)于ASH2L的研究,目前已經(jīng)在其結(jié)構(gòu)及功能兩方面取得明顯進(jìn)展。在結(jié)構(gòu)方面的研究,Ikegawa等于1999年成功克隆出了完整的人類ASH2L基因cDNA序列。人類ASH2L基因位于8號(hào)染色體,其基因組DNA長(zhǎng)度跨越34 kb。迄今已被發(fā)現(xiàn)有3種剪接異構(gòu)體,其中1型為最經(jīng)典的亞型,由628個(gè)氨基酸組成,包含16個(gè)外顯子,cDNA長(zhǎng)2368 bp。對(duì)ASH2L1的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域,即N端的PHD和HWH結(jié)構(gòu)域、中部的NLS核定位序列及C端的SPRY和SDI結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與ASH2L在細(xì)胞中的定位、蛋白間的相互作用及調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)。在功能研究方面,出于醫(yī)學(xué)倫理的考慮及小鼠Ash21蛋白與人ASH2L蛋白具有高度同源性,目前絕大多數(shù)對(duì)ASH2L蛋白功能的研究都是以小鼠為研究對(duì)象。研究已發(fā)現(xiàn),Ash2l-/-小鼠死于胚胎發(fā)育期；Ash21對(duì)維持胚胎干細(xì)胞(ES)的多向分化潛能及維持染色質(zhì)的開放狀態(tài)具有重要的作用；Ash21也可能參與到炎癥反應(yīng)、心肌肥大及肺動(dòng)脈高壓等疾病的發(fā)病過程中。本課題組的前期研究還發(fā)現(xiàn),ASH2L蛋白與癌蛋白MYC相互作用；在人類乳腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)升高；能夠與活化的Ha-RAS協(xié)同促進(jìn)原代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。由此可以推斷：ASH2L極有可能作為癌基因發(fā)揮作用。本課題組在前期研究中試圖在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)特異性地過表達(dá)ASH2L論證上述推測(cè),但很遺憾該推測(cè)未能被證實(shí)。小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ASH2L的過表達(dá)并不能夠誘發(fā)自發(fā)性肝癌或促進(jìn)二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌。過表達(dá)ASH2L不會(huì)影響肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、引起肝功能損害和肝臟組織學(xué)的改變。綜上所述,既往的研究已經(jīng)證明了ASH2L蛋白可以通過影響KMT2酶的活性而影響組蛋白修飾等基因的表觀遺傳調(diào)控。在ASH2L功能研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在維持ES細(xì)胞多向分化潛能及胚胎發(fā)育等方面的作用,但具體到ASH2L與癌癥的關(guān)系上卻面臨著困境。本課題組前期實(shí)驗(yàn)試圖利用ASH2L的過表達(dá)方式研究其在肝癌發(fā)生中的作用但未獲成功。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)換研究角度,不再通過ASH2L過表達(dá)的方式研究ASH2L的功能,而是通過敲除Ash2l方式反向推導(dǎo)Ash21蛋白的功能,這為深入研究ASH2L的功能奠定基礎(chǔ)。研究目的1.構(gòu)建條件性基因敲除動(dòng)物模型,研究敲除Ash2l對(duì)小鼠肝臟及個(gè)體發(fā)育的影響。2.在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中條件性地敲除Ash2l,研究其對(duì)細(xì)胞生理功能的影響,并探討其可能的機(jī)制。研究方法一、將基因型為Ash2lfl/fl的小鼠與Ash2l+/+Tg(AlbCre)的小鼠交配,得到子代Ash2l+/flTg(AlbCre)小鼠,讓其后代繼續(xù)交配,獲得實(shí)驗(yàn)組Ash2l敲除(Ash2l KO)小鼠Ash2lf/flTg(AlbCre)及不同基因型的對(duì)照組小鼠(Ash2lfl/fl, Ash2l+/fl, Ash2l+/flTg(AlbCre), Ash2l+/+, Ash2l+/+Tg(AlbCre))。所獲小鼠進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1.每天觀測(cè)小鼠的體重、一般情況、日常行為及臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)等,并且給予評(píng)分,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組小鼠評(píng)分超過20分時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。2. 處死小鼠前,稱重小鼠并用毛細(xì)玻璃管從小鼠眼內(nèi)眥眼眶后靜脈叢取血。分離獲得血清,進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及總膽紅素(TBIL)等與肝功能相關(guān)的酶學(xué)檢測(cè)。3.采用PCR方法檢測(cè)Ash2l在DNA和RNA水平上的敲除效率。4.采用Western blot方法檢測(cè)蛋白水平上Ash21的表達(dá)情況。5.采用HE、PAS、Gomori染色等方法評(píng)價(jià)敲除Ash2l后肝臟組織學(xué)變化。6.采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)小鼠肝臟組織切片進(jìn)行染色,分析Ash21、H3K4me3、Ki67和γH2A.X等的含量。7.小鼠肝組織切片TUNEL染色及cleaved caspase-3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡的情況。二、將基因型為Ash2lfl/fl的小鼠與Ash2l+/+Tg(CAGCreERT2)的小鼠交配,讓其后代繼續(xù)交配,從孕13.5天的雌鼠體內(nèi)篩選基因型為Ash2l+/+Tg(CAG-CreERT2)和Ash2lfl/flTg(CAGCreERT2)的小鼠胚胎,制備原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(pMEFs)。采用磷酸鈣瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將含有p19ARF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Plat-E,并收集生成的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染pMEFs。被病毒感染的pMEFs再經(jīng)過相應(yīng)抗生素篩選2周,獲得永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(iMEFs)。所制備的pMEFs和iMEFs于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1.采用PCR和Western blot的方法分別檢測(cè)Ash2l在DNA水平上的敲除效率和蛋白水平上的表達(dá)情況。2.通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及亞甲藍(lán)染色方法監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。3.采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)研究細(xì)胞周期的分布。4.采用Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。5.采用β-半乳糖苷酶染色方法檢測(cè)細(xì)胞衰老。6.采用Western blot和免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞總體和單個(gè)細(xì)胞內(nèi)Ash21、H3K4me3和γH2A.X的含量。7.采用Western blot方法檢測(cè)敲除Ash2l可能引起的iMEFs內(nèi)組蛋白修飾的改變。研究結(jié)果一、敲除Ash2l引起小鼠肝臟損傷。經(jīng)過在DNA、RNA及蛋白水平上對(duì)Ash2l敲除效率的驗(yàn)證,成功構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性基因敲除小鼠模型。Ash2l KO小鼠形體較小,生長(zhǎng)遲緩,活動(dòng)減少。在終止實(shí)驗(yàn)前,6只Ash2l KO小鼠死亡,平均死亡年齡26.17±9.19天。與對(duì)照組相比,存活的雌性和雄性Ash2l KO小鼠的體重均明顯下降(雌鼠：7.45±2.36 g(KO)vs.11.19±4.61 g(C),P0.05；雄鼠：6.56±1.05g(KO)vs.8.06±1.84 g(C),P0.05)血清酶學(xué)檢測(cè)顯示：Ash2l KO小鼠較對(duì)照組小鼠的ALP、ALT、AST水平明顯升高(ALP:2022.20±195.70 U/L(KO)vs.467.05±52.01 U/L(C), P0.001;ALT:110.68±17.77 U/L(KO)vs.49.96±6.70 U/L(C),P0.001; AST:248.34±37.75 U/L(KO)vs.104.31±17.52 U/L(C),P0.001); TBIL水平也有所升高,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48.26±12.33 μmol/L(KO)vs.17.90±10.42 μmol/L(C),P=0.070)小鼠肝臟的組織學(xué)分析顯示,Ash2l KO小鼠肝細(xì)胞內(nèi)Ash21蛋白表達(dá)下降同時(shí)伴有H3K4me3的缺失,但在肝臟其他類型的細(xì)胞中,仍可見Ash21蛋白及H3K4me3的存在,如Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。小鼠肝組織切片HE染色顯示,不同基因型對(duì)照組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)一致,未見明顯異常,而Ash2l KO小鼠肝細(xì)胞脹大,胞漿呈疏松態(tài),出現(xiàn)氣球樣變,并伴有羽毛狀變性。且隨著小鼠天齡的增加,Ash2l KO小鼠肝臟的膽管反應(yīng)明顯。PAS染色顯示其含有蠟樣質(zhì)的巨噬細(xì)胞增多,改良的Gomori染色顯示其部分區(qū)域內(nèi)肝細(xì)胞塌陷,門靜脈橋接纖維化。在超過11天齡的小鼠肝臟細(xì)胞中,敲除Ash2l可以引起Ki67升高,肝細(xì)胞核變大、深染。此外,Ash2l KO和對(duì)照組小鼠的肝細(xì)胞在cleaved caspase-3和TUNEL染色上無(wú)明顯差異,在部分Ash2l KO小鼠肝細(xì)胞中γH2A.X升高。二、敲除Ash2l抑制細(xì)胞增殖。經(jīng)過在DNA及蛋白水平上對(duì)Ash2l敲除效率的驗(yàn)證,成功建立了可誘導(dǎo)Ash2l敲除的MEFs.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及亞甲藍(lán)染色結(jié)果顯示,敲除Ash2l可抑制MEFs的增殖。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示,Ash2l KO pMEFs明顯阻滯于G0/G1期,同時(shí)伴有S期細(xì)胞比例的明顯下降。運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)經(jīng)AnnexinV-FITC/PI染色的Ash2l KO MEFs的凋亡情況時(shí)發(fā)現(xiàn)：在干擾Ash21表達(dá)7天后,與對(duì)照組相比,iAsh2lfl/flMEFs在FSC和SSC軸上分布彌散,細(xì)胞凋亡顯著增加(AnnexinV+:18.19±1.15% (+HOT)vs.7.55士1.49%(-HOT),P0.05:AnnexinV+PI-:10.38±0.49% (+HOT)vs.0.92±0.07%(-HOT),P0.001),而HOT的誘導(dǎo)并不能促進(jìn)iAsh2l+/+ MEFs的凋亡(AnnexinV+:11.01±0.27%(+HOT)vs.11.92± 1.33%(-HOT),P=0.359:AnnexinV+PI-:2.14±0.17%(+HOT)vs.2.25 ±0.49%(-HOT),P=0.739).與iMEFs細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果一致,經(jīng)過HOT誘導(dǎo)7天后,pAsh2lfl/flMEFs與對(duì)照組相比,凋亡細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的比例均顯著升高(AnnexinV+:34.13±0.85%(+HOT)vs.22.93±0.37% (-HOT),P0.001:AnnexinV+PI-:22.30±0.95%(+HOT)vs.13.00± 0.50%(一HOT),P0.001),pAsh2l+/+MEFs在經(jīng)過HOT處理后與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(AnnexinV+:24.62±1.72%(+HOT)vs.26.87±1.42%(-HOT),P=0.157:AnnexinV+PI-:13.60±0.46%(+HOT)vs.14.10±1.21%(-HOT),P=0.541)。此外,收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),iAsh2lfl/flMEFs在經(jīng)過HOT誘導(dǎo)處理7天后有63.90±0.61%的懸浮細(xì)胞處于早期凋亡階段。對(duì)照組iAsh2lfl/flMEFs(±HOT)及iAsh2lfl/flMEFs(-HOT)由于懸浮細(xì)胞極少,無(wú)法收集到足夠的細(xì)胞用于凋亡檢測(cè)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),iAsh2l KO MEFs形態(tài)不規(guī)則,體積增大、扁平,細(xì)胞核變大。β.半乳糖苷酶染色顯示,iAsh2lfl/flMEFs和iAsh2lfl/fl在經(jīng)過HOT誘導(dǎo)5天后,p-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞比例與未經(jīng)HOT處理的對(duì)照組相比顯著升高(iAsh2lfl/fl:65.04±4.35%(+HOT)vs.1.24±0.62%(-HOT), P0.001:iAsh2lfl/fl:72.19±3.17%(+HOT)vs.2.58±0.49%(-HOT), P0.001).iAsh2l+/+MEFs在經(jīng)過HOT處理后,陽(yáng)性細(xì)胞比例也明顯升高,但均低于3%(iAsh2l+/+:2.59±1.01%(+HOT)vs.0.95±0.05%(-HOT), P=0.048:iAsh2l+/+:1.88±0.19%(+HOT)v.0.86±0.11%(-HOT),P =0.001).Western blot顯示iAsh2l KO iMEFs內(nèi)總體yH2A.X的含量升高,免疫熒光檢測(cè)顯示部分Ash21缺失的iMEFs內(nèi)γH2A.X含量升高。采用Western blot方法檢測(cè)敲除Ash2l后iMEFs內(nèi)組蛋白修飾的改變,發(fā)現(xiàn)干擾Ash21表達(dá)后H3K4mel/me2/me3修飾水平下降,而對(duì)其他組蛋白翻譯后修飾如H3K9ac、H3K9me3、H3K27ac和H3K27me3等沒有影響。免疫熒光檢測(cè)顯示在Ash21缺失的iMEFs內(nèi)H3K4me3的修飾也隨之消失。結(jié)論1.成功構(gòu)建的肝細(xì)胞特異性基因敲除動(dòng)物模型證明,敲除Ash2l基因?qū)е滦∈蟪錾蟾闻K功能受損、個(gè)體發(fā)育遲緩甚至死亡。2.Ash2l KO小鼠肝臟組織學(xué)的改變可能是由Ash21蛋白缺失引起的H3K4me3修飾異常所致。3.成功構(gòu)建的可誘導(dǎo)條件性基因敲除MEFs證明,敲除Ash2l基因可以抑制細(xì)胞的增殖。4.Ash21蛋白缺失引發(fā)的細(xì)胞生長(zhǎng)受抑可能是通過促進(jìn)細(xì)胞衰老及一定程度上的細(xì)胞凋亡而形成的。研究意義1.首次建立了肝細(xì)胞特異性Ash21敲除動(dòng)物模型,證明了Ash21基因?qū)S持正常肝臟功能及個(gè)體發(fā)育具有重要意義。2.進(jìn)一步研究并證明了Ash21基因?qū)?xì)胞增殖的作用。3.為ASH2L基因作為潛在的癌基因治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R73-3
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本文編號(hào)：2178598