【摘要】：灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.來(lái)源于忍冬科,為中藥材山銀花來(lái)源之一,其藥材為干燥花蕾或初開(kāi)的花。具有清熱解毒,疏散風(fēng)熱之功效。用于癰腫療瘡,喉痹,丹毒,熱毒血痢,風(fēng)熱感冒,溫?zé)岚l(fā)病。但是長(zhǎng)期以來(lái),如何解決灰氈毛忍冬蕾期短,采摘不及時(shí)是灰氈毛忍冬生產(chǎn)和應(yīng)用中一個(gè)棘手的問(wèn)題。研究工作者從1999年開(kāi)始以灰氈毛忍冬的自然變異株為接穗,通過(guò)多年嫁接篩選試驗(yàn),初步培育出了花蕾期長(zhǎng),花冠不展開(kāi)的無(wú)性系的灰氈毛忍冬,命名“湘蕾金銀花”品種。通過(guò)前期對(duì)灰氈毛忍冬進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組denovo測(cè)序分析,獲得了海量功能明確、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的灰氈毛忍冬基因序列,為灰氈毛忍冬的深入研究提供了大量數(shù)據(jù),其中兩個(gè)品種表達(dá)量具有明顯差異的Unigene基因共20709條。其中,獲得具有重要調(diào)控功能的MADS-box家族基因重要基因4條,現(xiàn)選取其中AGL15同源基因克隆并驗(yàn)證其表達(dá)。本論文以灰氈毛忍冬品種為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)同源克隆的辦法,分別從其莖、葉和各不同時(shí)期花蕾中成功分離了灰氈毛忍冬LmAGL15這個(gè)花育相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng),同時(shí)借助實(shí)時(shí)定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR)的方法,對(duì)該基因在不同部位灰氈毛忍冬組織及花育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了分析。同時(shí),分別構(gòu)建了LmAGL15基因的過(guò)表達(dá)和干擾植物表達(dá)載體,將載體轉(zhuǎn)入擬南芥,經(jīng)驗(yàn)證后,得到部分陽(yáng)性植株。主要研究結(jié)果如下:1.根據(jù)已知基因的保守序列設(shè)計(jì)并引物,采用RACE的方法,第一次從灰氈毛忍冬品種的莖、葉及各不同時(shí)期花蕾中成功獲得了AGL15該相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng),命名為L(zhǎng)mAGL15(GenBank登錄號(hào):KR028478)。序列分析表明,該基因含有MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域,屬于MADS-box基因家族。2.采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法,以18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因,對(duì)LmAGL15基因在灰氈毛忍冬不同部位組織中的表達(dá)差異進(jìn)行分析,LmAGL15基因在不同的部位組織中有不同的表達(dá)模式,具有一定的組織特異性。其中LmAGL15主要在花蕾中表達(dá),葉和莖中幾乎沒(méi)有表達(dá)。對(duì)LmAGL15基因在灰氈毛忍冬花育過(guò)程中的表達(dá)差異進(jìn)行分析,該基因在花育過(guò)程中有具有一定的時(shí)間特異性。其中LmAGL15在花分化前期表達(dá)最高,后期表達(dá)最低。3.成功構(gòu)建了LmAGL15的過(guò)表達(dá)和干擾植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)驗(yàn)證,初步得到陽(yáng)性植株。4.LmAGL15基因在擬南芥中過(guò)表達(dá),通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥都能夠延遲開(kāi)花。初步表明LmAGL15基因可能對(duì)花期調(diào)控具有重要的作用。
[Abstract]:Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. It comes from Lonicera, which is one of the Chinese medicinal materials, and its medicinal material is dried flower bud or first blooming flower. It has the effect of clearing heat and detoxifying, dispersing wind and heat. Used for treating carbuncle, larynx, erysipelas, heat-toxic blood dysentery, wind-heat cold, warm fever. But for a long time, how to solve the problem of short bud period and untimely picking is a thorny problem in production and application of Lonicera japonica. Since 1999, the natural variant plant of Lonicera feldis was used as scion. Through many years of grafting screening experiment, the clone of Lonicera feldis with long bud stage and non-spreading flower crown was preliminarily cultivated and named "Honeysuckle in Hunan bud". Through denovo sequencing and analysis of the transcription group of Lonicera feldis in the early stage, a large number of functional and independent intellectual property rights gene sequences were obtained, which provided a large number of data for the further study of Lonicera feldis. There were 20709 Unigene genes with significant difference in expression between the two varieties. Among them, 4 important genes of MADS-box family were obtained, among which AGL15 homologous genes were cloned and their expression was verified. In this paper, LmAGL15, a floral related gene, was isolated from the stem, leaves and buds of Lonicera tenuifolia by homologous cloning. At the same time, the temporal and spatial expression patterns of the gene in different parts of Lonicera feldis were analyzed by real-time quantitative PCR (realtime fluorescence quantitative PCR). At the same time, the overexpression and interference plant expression vectors of LmAGL15 gene were constructed, and the vectors were transferred into Arabidopsis thaliana. After verification, some positive plants were obtained. The main results are as follows: 1. According to the conserved sequence of known gene and primer, the cDNA length of AGL15 gene was successfully obtained from stem, leaf and flower buds of Lonicera feldis by RACE method for the first time, and named LmAGL15 (GenBank accession number: KR028478). Sequence analysis showed that the gene contained MADS domain and K domain, belonging to the MADS-box gene family. The expression differences of LmAGL15 gene in different parts of Lonicera feldis were analyzed by using real-time quantitative PCR and 18SrRNA gene as internal reference gene. There were different expression patterns of LmAGL15 gene in different tissues. It has a certain tissue specificity. LmAGL15 was mainly expressed in buds, but hardly in leaves and stems. The difference of expression of LmAGL15 gene in flowering process of Lonicera feldis was analyzed. The expression of LmAGL15 was the highest in the early stage of flower differentiation and the lowest in the late stage. The overexpression and interfering plant expression vector of LmAGL15 was successfully constructed, and transformed into Arabidopsis thaliana. The positive plant. 4. LmAGL15 gene was overexpressed in Arabidopsis thaliana. Through the phenotype of transgenic plants, it was found that transgenic Arabidopsis could delay flowering. It is suggested that LmAGL15 gene may play an important role in the regulation of flowering.
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S567.79

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本文編號(hào)：2173118