發(fā)布時間：2018-08-01 16:35

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一類在生物體內(nèi)長度約為22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA,通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與調(diào)節(jié)多種生命活動。飛蝗是世界性的重要農(nóng)業(yè)害蟲,表皮周而復(fù)始的合成與降解對其正常蛻皮發(fā)育起著重要作用。飛蝗表皮幾丁質(zhì)的代謝是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,幾丁質(zhì)的合成和降解過程主要由幾丁質(zhì)合成酶和幾丁質(zhì)酶等關(guān)鍵酶精確調(diào)控。本課題組前期研究已表明幾丁質(zhì)代謝酶—幾丁質(zhì)合成酶1(Chitin Synthase 1,CHS1)和幾丁質(zhì)酶10(Chitinase 10,CHT10)的精確表達在蛻皮發(fā)育中起關(guān)鍵作用;同時,我們的研究發(fā)現(xiàn)飛蝗miRNA合成通路中LmDicer1基因沉默抑制了成熟體miRNAs的合成,并導(dǎo)致蝗蟲蛻皮異常而死亡。由此我們提出科學(xué)假設(shè):飛蝗miRNAs可能參與調(diào)控表皮代謝關(guān)鍵基因,從而影響昆蟲正常蛻皮發(fā)育。本文以重要農(nóng)業(yè)害蟲飛蝗為研究對象,研究了飛蝗LmDicer1和LmAGO1在mi RNA合成中的作用,更新了飛蝗miRNAs文庫并揭示了miRNA對飛蝗表皮代謝基因的調(diào)控機制。主要內(nèi)容如下:1、飛蝗小RNA文庫的構(gòu)建及miRNAs的鑒定通過高通量測序和實驗驗證,我們鑒定獲得833個飛蝗miRNAs。發(fā)現(xiàn)隨著飛蝗基因組的擴張其體內(nèi)miRNA也相應(yīng)增多,其中多個miRNAs是飛蝗特異的。采用RNAi技術(shù)干擾miRNA合成通路上的關(guān)鍵基因Drosha,并對其miRNA進行高通量測序,與對照組(dsGFP)相比進一步證明了miRNA庫的真實性,飛蝗miRNA的鑒定研究為揭示miRNA在飛蝗體內(nèi)的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。2、LmDicer1對miRNA合成及飛蝗蛻皮發(fā)育的影響為了闡明飛蝗miRNA合成通路中的關(guān)鍵因子Dicer1在miRNA合成中的作用及對飛蝗生命活動的影響,我們采用RNA干擾(RNAi)及熒光定量PCR(RT-qPCR)等技術(shù)分析LmDicer1的表達特性及對飛蝗體內(nèi)miRNA合成的影響。結(jié)果表明:干擾LmDicer1可抑制飛蝗miRNA的合成,從而對飛蝗的蛻皮發(fā)育產(chǎn)生影響,導(dǎo)致飛蝗蛻皮異常而死亡。3、Argonaute 1在miRNA合成和飛蝗發(fā)育中的作用為了闡明miRNA合成通路中的關(guān)鍵因子Argonaute 1(AGO1)在miRNA形成中的作用,我們采用RNA干擾(RNAi)和熒光定量PCR(RT-qPCR)等技術(shù)分析LmAGO1的表達及對體內(nèi)miRNA形成的影響。發(fā)現(xiàn)飛蝗AGO1蛋白不僅可以與miRNA形成RISC復(fù)合體指導(dǎo)miRNA與靶標基因結(jié)合,而且具有核酸內(nèi)切酶的作用,參與體內(nèi)成熟體miRNA的合成與表達,影響飛蝗正常生長發(fā)育。4、miRNAs對飛蝗表皮幾丁質(zhì)合成酶和降解酶基因的調(diào)控我們進一步研究了miRNAs在飛蝗蛻皮發(fā)育過程中的功能。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測得到miR-71和miR-263分別與飛蝗CHS1和CHT10有結(jié)合位點;通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-71和miR-263與LmCHS1和LmCHT10的表達呈負相關(guān)關(guān)系;利用體外熒光素酶實驗和RNA免疫共沉淀(RIP)實驗分析發(fā)現(xiàn)miR-71和miR-263分別與LmCHS1和LmCHT10有直接相互作用;通過體內(nèi)顯微注射miR-71/mi R-263的激動劑和抑制劑,發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)過表達或者沉默miR-71/miR-263,與對照組相比飛蝗因蛻皮困難而死亡。研究結(jié)果表明飛蝗miR-71和miR-263分別通過調(diào)控LmCHS1和LmCHT10的表達影響新表皮幾丁質(zhì)的合成和舊表皮幾丁質(zhì)的降解,導(dǎo)致飛蝗蛻皮異常而死亡。5、miRNAs對飛蝗表皮代謝基因的調(diào)控為了探究miRNAs是否對其他表皮代謝關(guān)鍵基因有調(diào)控作用,我們進一步選取了參與表皮代謝的關(guān)鍵基因:脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophorylase,UAP)、糖基轉(zhuǎn)移酶(asparagine-linked glycosylation protein 5,ALG5)和Sinuous,通過生物信息學(xué)方法預(yù)測了與這些關(guān)鍵基因結(jié)合的潛在miRNAs,并通過RT-qPCR、體外免疫共沉淀(RIP)、體外熒光素酶等實驗驗證了表皮代謝基因與miRNAs之間的相互作用關(guān)系。結(jié)果表明與4個關(guān)鍵表皮代謝基因UAP、ALG5、FAS、和Sinuous潛在結(jié)合的miRNAs分別是miRNA-2796、miRNA-275、miRNA-276b和miRNA-184,而且這些miRNAs分別與4個表皮代謝基因之間有相互作用,可能調(diào)控了其靶標基因的表達。綜上所述,本文系統(tǒng)闡明了飛蝗miRNAs的合成、鑒定并揭示了miRNAs在蛻皮發(fā)育中對表皮代謝相關(guān)基因的分子調(diào)控機制,研究結(jié)果將為篩選飛蝗防治中潛在的小分子靶標,設(shè)計環(huán)境友好型的綠色藥物提供重要的科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:MicroRNAs (miRNAs) is a class of endogenous non coded RNA, which is about 22 NT in length, and participates in regulating a variety of life activities through post transcriptional regulation. Locust is an important agricultural pest in the world. The synthesis and degradation of epidermis plays an important role in the development of normal molting. The metabolism of chitin in cuticle epidermis is a The synthesis and degradation process of chitin is regulated by some key enzymes, such as chitin synthetase and chitinase, and the precise expression of chitin synthetase - chitin synthetase 1 (Chitin Synthase 1, CHS1) and chitinase 10 (Chitinase 10, CHT10) in the development of molt At the same time, our study found that LmDicer1 gene silencing in the miRNA synthesis pathway of locusts inhibited the synthesis of miRNAs in mature body and resulted in the abnormal death of locusts and molting. Therefore, we put forward scientific hypothesis that the miRNAs may participate in the regulation of key genes of epidermal metabolism and affect the normal molting development of insects. The effects of locusts LmDicer1 and LmAGO1 in the synthesis of MI RNA were studied, the miRNAs Library of locust and the regulatory mechanism of miRNA on the epidermal metabolism genes of locusts were updated. The main contents are as follows: 1, the construction of the small RNA Library of the locust and the identification of miRNAs by high throughput sequencing and experimental verification, we have identified 833 MiRNAs. found that with the expansion of the locust genome, the number of miRNA in the body increased correspondingly, and many of them were specific to the locust. RNAi technology was used to interfere with the key gene Drosha on the miRNA synthesis pathway, and the high flux sequencing of the miRNA was carried out. Compared with the control group (dsGFP), the authenticity of the miRNA library was further proved, and the miRNA of the locust was miRNA. Identification studies have laid the foundation for revealing the biological function of miRNA in the locust. The effect of LmDicer1 on miRNA synthesis and the development of the molting of locusts in order to clarify the role of Dicer1 in miRNA synthesis and the effect on the life of locust in the miRNA synthesis pathway of locusts, we use RNA interference (RNAi) and fluorescent quantitative PCR (RT-qP). CR) and other techniques to analyze the expression characteristics of LmDicer1 and the effect on miRNA synthesis in the locust. The results show that interference of LmDicer1 can inhibit the synthesis of miRNA in locusts, thus affecting the development of the molting of locusts, resulting in abnormal.3 of the molt of locusts, and the role of Argonaute 1 in the synthesis of miRNA and the development of locusts in order to clarify the miRNA synthesis pathway The key factor, Argonaute 1 (AGO1), in the formation of miRNA, we use RNA interference (RNAi) and fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) to analyze the expression of LmAGO1 and its effect on the formation of miRNA in the body. It is found that the AGO1 protein of locusts can not only combine with miRNA forming RISC complex to guide the binding of the target gene, but also have the nucleic acid internal cutting. The action of enzymes involved in the synthesis and expression of miRNA in the mature body of the body, affecting the normal growth and development of the locust,.4, and the regulation of miRNAs on the chitin synthetase and degrading enzyme genes of the cuticle epidermis. We further studied the function of miRNAs in the development of the molting of locusts. Using bioinformatics methods, we have predicted miR-71 and miR-263 and the CH of locust respectively. There was a binding site between S1 and CHT10, and the expression of miR-71 and miR-263 was negatively correlated with the expression of LmCHS1 and LmCHT10 by RT-qPCR detection. The use of in vitro luciferase experiment and RNA immunoprecipitation (RIP) experimental analysis found that miR-71 and miR-263 were directly used for LmCHS1 and LmCHT10, respectively. Agents and inhibitors were found to overexpress or silence miR-71/miR-263 in the body. Compared with the control group, locusts died of molting difficulties. The results showed that the miR-71 and miR-263 of locusts affected the synthesis of the new epidermal chitin and the degradation of the old epidermal chitin by regulating the expression of LmCHS1 and LmCHT10 respectively, resulting in the abnormal death of the cuticle and the death of.5 in the molting of the locust. MiRNAs regulates the epidermal metabolism genes of locusts in order to explore the regulation of miRNAs on other key genes of epidermal metabolism. We further selected key genes involved in epidermal metabolism: fatty acid synthase (FAS), UDP-N- acetaminophen pyrophosphorylase (UDP-N-acetylglucosamine pyrophorylase, U). AP), glycosyltransferase (asparagine-linked glycosylation protein 5, ALG5) and Sinuous predicted the potential miRNAs in combination with these key genes through bioinformatics, and tested the interaction between the epidermal metabolism gene and miRNAs through RT-qPCR, in vitro immunoprecipitation (RIP) and in vitro luciferase. The potential combination of 4 key epidermal metabolic genes, UAP, ALG5, FAS, and Sinuous, is miRNA-2796, miRNA-275, miRNA-276b and miRNA-184, respectively, and these miRNAs respectively interact with 4 epidermal metabolism genes, which may regulate the target gene expression. In summary, this paper systematically clarifies the combination of the miRNAs of locusts. The results will provide important scientific basis for the screening of the potential small molecular targets in the control of locusts and the design of environmentally friendly green drugs by identifying and revealing the molecular regulation mechanism of miRNAs in the development of molt.
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q963

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本文編號：2158175