【摘要】：目的:Nanos基因編碼一種含鋅指結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白,可以與其起協(xié)同作用的Pumilio蛋白結(jié)合,在原始生殖細(xì)胞生存相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到重要作用。Nanos蛋白在時(shí)間、空間上對基因轉(zhuǎn)錄翻譯和m RNA定位的調(diào)控,是啟動(dòng)果蠅胚胎后極化發(fā)育過程的關(guān)鍵機(jī)制。Nanos基因在原始生殖細(xì)胞的遷移和分化過程中發(fā)揮重要的功能,并且在秀麗隱桿線蟲、斑馬魚、家蠶、非洲蟾蜍和小鼠等測試動(dòng)物的生長發(fā)育方面也起到必不可少的作用。由于Nanos基因與大多數(shù)物種生殖器官的發(fā)育密切相關(guān),因此我們推測日本血吸蟲Nanos基因編碼的蛋白在其生殖器官的發(fā)育中也起一定的作用。方法:首先,使用DNAMAN軟件和NCBI中BLAST,進(jìn)行Nanos蛋白的同源性分析,來確定日本血吸蟲Nanos的分型;然后再通過原位雜交的方法,探究Nanos基因在日本血吸蟲的定位情況;隨后,用針對Nanos基因的si RNA轉(zhuǎn)染感染后28天合抱的日本血吸蟲,體外培養(yǎng)10天,期間每隔3天轉(zhuǎn)染一次si RNA,共轉(zhuǎn)染三次;使用TRIzol方法提取蟲體總RNA和總蛋白,通過熒光定量PCR以及Western blot方法分析其在m RNA和蛋白水平的消減情況;Nanos基因干擾后,使用鹽酸胭脂紅染色蟲體的方法,通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察日本血吸蟲生殖器官的形態(tài)改變;我們還使用普通光學(xué)顯微鏡觀察Nanos基因的干擾對日本血吸蟲蟲卵數(shù)量的影響;最后,在Nanos基因消減后,通過熒光定量PCR方法檢測可能與Nanos基因相互作用以及蟲卵形成相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果:Nanos蛋白同源性分析結(jié)果顯示,日本血吸蟲Nanos1(SjNanos1)蛋白與曼氏血吸蟲Nanos2蛋白同源性為43%,與曼氏血吸蟲Nanos1蛋白同源性為25%。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,曼氏血吸蟲Nanos2主要表達(dá)在卵黃腺中,可能與生殖系統(tǒng)發(fā)育相關(guān),故將SjNanos1基因作為本課題的研究對象;原位雜交的結(jié)果顯示,SjNanos1基因主要表達(dá)在合抱后日本血吸蟲雌蟲和雄蟲生殖器官中,而合抱前的日本血吸蟲并未發(fā)現(xiàn)SjNanos1基因的表達(dá);SjNanos1基因的si RNA干擾后,與空白組相比,SjNanos1的表達(dá)在m RNA和蛋白質(zhì)水平均顯著降低;激光共聚焦掃描顯微鏡的觀察結(jié)果顯示,SjNanos1基因消減后,在日本血吸蟲雄蟲中,睪丸輕微收縮,并且在睪丸的腹側(cè)部分幾乎沒有觀察到成熟的細(xì)長的精子;同時(shí),在每個(gè)睪丸中都發(fā)現(xiàn)有明顯的裂隙。對于血吸蟲雌蟲,其卵巢中成熟卵母細(xì)胞減少,不成熟卵母細(xì)胞增多,卵黃腺中成熟的卵黃細(xì)胞也明顯減少并且卵黃細(xì)胞也明顯萎縮;在SjNanos1基因消減后,通過普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)雌蟲的產(chǎn)卵數(shù)量在第4、第7天和第10天時(shí)分別下降了大約41%、56%和71%,并且雌蟲子宮中蟲卵的數(shù)量也明顯減少,培養(yǎng)10天下降了50%左右;此外,SjNanos1基因沉默也影響了與SjNanos1基因相互作用的以及蟲卵形成相關(guān)基因的變化,如Pumilio,CNOT6L和Fs800基因。在SjNanos1基因干擾后第10天,Pumilio基因的表達(dá)量增加了3倍左右,CNOT6L基因的表達(dá)水平下降了約50%。更值得注意的是,Fs800基因在日本血吸蟲中的表達(dá)減少約90%。結(jié)論:通過干擾日本血吸蟲SjNanos1基因的表達(dá),血吸蟲雌蟲卵巢、卵黃腺和雄蟲睪丸形態(tài)發(fā)生明顯的變化,并且雌蟲的產(chǎn)卵量也受到顯著的影響,因此我們可以得出結(jié)論,SjNanos1基因在日本血吸蟲生殖器官的發(fā)育以及蟲卵的形成和產(chǎn)生中發(fā)揮重要的功能。
[Abstract]:Objective: the Nanos gene encodes a RNA binding protein containing the zinc finger structure, which can play an important role in the coordination of Pumilio protein, which plays an important role in the transcription regulation of the survival related genes of the primitive germ cells..Nanos protein is in time, and the regulation of gene translation and m RNA localization in space is to start the post polarization hair of the Drosophila melanogaster. .Nanos gene plays an important role in the migration and differentiation of primordial germ cells, and plays an essential role in the growth and development of Caenorhabditis elegans, zebrafish, silkworm, African toad and mice, as well as the development of the Nanos gene and the reproductive organs of most species. Therefore, we speculate that the protein encoded by the Nanos gene of Schistosoma japonicum also plays a role in the development of its reproductive organs. Methods: first, using DNAMAN software and BLAST in NCBI to analyze the homology of Nanos protein to determine the typing of Nanos in Schistosoma japonicum, and then to explore the Nanos gene by the method of in situ hybridization. In the location of Schistosoma japonicum, then transfected with Si RNA of Nanos gene for 28 days after infection, the Schistosoma japonicum was cultured for 10 days in vitro, and Si RNA was transfected once every 3 days and three times were transfected. TRIzol method was used to extract the total insect RNA and total protein, and the M RNA and Western blot methods were analyzed by fluorescence quantitative PCR and Western blot methods. After Nanos gene interference, the morphological changes of the reproductive organs of Schistosoma japonicum were observed by laser confocal scanning microscope with the method of carmine dyed with carmine. We also observed the effect of the interference of Nanos gene on the number of eggs of Schistosoma japonicum by ordinary optical microscope; finally, in the Nanos base After the reduction, the changes in the interaction of Nanos gene and the gene expression level of the egg formation were detected by the fluorescence quantitative PCR method. Results: the Nanos protein homology analysis showed that the homology of the Nanos1 (SjNanos1) protein of Schistosoma japonicum and the Nanos2 protein of Schistosoma mansoni was 43%, and the homology of the Nanos1 protein of Schistosoma mansoni. According to 25%., it is reported that the Nanos2 of Schistosoma mansoni is mainly expressed in the yolk gland and may be related to the development of the reproductive system. Therefore, the SjNanos1 gene is used as the subject of this study. The results of in situ hybridization show that the SjNanos1 gene is mainly expressed in the female and male reproductive organs of the Schistosoma japonicum after the clasp, and the Japanese blood sucking before the joint is held. The SjNanos1 gene was not found in the insect; the expression of SjNanos1 in the m RNA and protein levels decreased significantly after the Si RNA interference of the SjNanos1 gene. The results of the confocal laser scanning microscope showed that after the reduction of SjNanos1 gene, the testicles contracted slightly in the Japanese blood sucking males and the ventral side of the testicles. Part of the mature slender sperm was almost not observed; at the same time, obvious fissures were found in each testis. For schistosomiasis, the mature oocyte in the ovary decreased, the immature oocyte increased, the yolk cells in the yolk gland decreased obviously and the yolk cells atrophied obviously; the SjNanos1 gene subtracted. Then, the number of eggs was counted by ordinary optical microscopy, and the number of eggs dropped by about 41%, 56% and 71%, respectively, at fourth, seventh and tenth days, and the number of eggs in the womb of the female decreased significantly, and the culture decreased by about 50% in 10 days. In addition, the SjNanos1 gene silencing also affected the interaction with the SjNanos1 gene. Changes in the genes related to the formation of eggs, such as Pumilio, CNOT6L and Fs800 genes. The expression of Pumilio gene increased by about 3 times after the SjNanos1 gene interference, and the expression level of the CNOT6L gene decreased by about 50%.. The expression of Fs800 gene in Schistosoma japonicum was reduced by about 90%. conclusion: by interfering with the Japanese blood sucking. The expression of the SjNanos1 gene, the ovary of the female schistosomiasis, the yolk gland and the testis of the male, and the egg production of the female are also significantly affected. Therefore, we can conclude that the SjNanos1 gene plays an important role in the development of the reproductive organs of Schistosoma japonicum and the formation and production of the eggs.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R383.24

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本文編號：2149950