【摘要】：本實驗室利用轉(zhuǎn)臂式生物反應(yīng)器(RWVB)所產(chǎn)生的模擬微重力環(huán)境對小鼠受精卵進行體外培養(yǎng),以平面培養(yǎng)作為對照,觀察模擬微重力環(huán)境對小鼠受精卵的影響情況。通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)C57小鼠受精卵在hCG 20h、hCG后20h平面培養(yǎng)9h與hCG后20h微重力培養(yǎng)9h存在7個差異基因。本實驗以昆明小鼠為研究對象,通過Q-PCR方法驗證這七個差異基因:Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papolog的相對表達情況,與單細胞測序結(jié)果進行比較計算準(zhǔn)確率。挑選出差異基因Ndufa4,通過Q-PCR、構(gòu)建載體、干擾、顯微注射等方法研究Ndufa4的功能機制。以hCG 20h為對照組(A組)、繼續(xù)平面培養(yǎng)9h(D組)、繼續(xù)微重力培養(yǎng)條件下培養(yǎng)9h(E組)。本實驗室黨楠楠通過單細胞測序發(fā)現(xiàn):D與E組表達差異1.5倍以上的基因共7個。本實驗通過Q-PCR方法在昆明小鼠受精卵對Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papolog這七個單細胞測序結(jié)果驗證發(fā)現(xiàn):這七個基因在D組與E組相對表達量顯著差異的基因有Lars2、Tmem59、Ndufa4和1600010M07Rik;D組與E組相對表達量顯著不差異的基因為Papolg與Nts;而Teddm1b基因則由于表達量過低未檢測出。單細胞測序結(jié)果驗證結(jié)果準(zhǔn)確率為66.7%。初步篩選出Ndufa4基因,以hCG后20 h時雌雄原核均出現(xiàn)的狀態(tài)作為受精標(biāo)志,構(gòu)建Ndufa4的表達載體與干擾SiRNA,通過顯微注射觀察對受精卵的發(fā)育影響。結(jié)果顯示:顯微注射后小鼠受精卵囊胚率顯著降低。以hCG 20h后顯微注射水為對照,顯微注射pEGFP-Ndufa4表達載體為實驗組,通過Q-PCR檢測Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因(其中Bax、Bak為促凋亡基因,Bcl-xl與Bcl-2為抑凋亡基因)的相對表達量。結(jié)果表明:過表達Ndufa4基因會使小鼠Bax與Bak顯著升高;引起細胞線粒體凋亡的蛋白cyt C的相對表達量也顯著升高。以hCG 20h后顯微注射水為對照,顯微注射Ndufa4的SiRNA為實驗組,通過Q-PCR檢測Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因(其中Bax、Bak為促凋亡基因,Bcl-xl與Bcl-2為抑凋亡基因)的相對表達量。結(jié)果表明:干擾小鼠Ndufa4基因的表達會導(dǎo)致Bax的相對表達量顯著升高;cytC的相對表達量也顯著升高。Ndufa4的過表達或者干擾均可能會影響凋亡因子的表達,最終導(dǎo)致受精卵凋亡。
[Abstract]:In our laboratory, the simulated microgravity environment produced by (RWVB) was used to culture mouse fertilized eggs in vitro, and the effect of simulated microgravity environment on mouse fertilized eggs was observed using plane culture as control. By single cell sequencing, seven differentially expressed genes were found in the fertilized eggs of C57 mice cultured at 20 h after hCG 20 h hCG and 9 h in microgravity culture at 20 h after hCG. In this study, Kunming mice were used to study the relative expression of the seven differential genes Tmem59 (Tmem59) Teddm1bQ-PCR 1600010M07RikTts and Ndufa4Nts and Papolog, and compared with the results of single cell sequencing. The differential gene Ndufa4 was selected to study the functional mechanism of Ndufa4 by Q-PCR, vector construction, interference and microinjection. HCG was used as the control group (group A) for 20 h, the plane culture was continued for 9 h (group D), and the culture condition of microgravity was continued for 9 h (group E). By single cell sequencing, we found that there were seven genes in group E and D, which were more than 1.5 times different. In this study, seven single-cell sequencing results of Tmem59-Teddm1bC1600010M07RikNts and Papolog in fertilized eggs of Kunming mice showed that the relative expression of these seven genes in group D and E were significantly different from those in group D and E: Lars2Tmem59Ndufa4 and 16000M07Rikhe. No significant difference was found between Papolg and NTS, while the Teddm1b gene was not detected due to its low expression level. The accuracy of single cell sequencing was 66.7%. The Ndufa4 gene was preliminarily screened, and the expression vector and interference siRNAs of Ndufa4 were constructed by using the state of both female and male prokaryotes at 20 h after hCG as the fertilization marker. The effects of microinjection on the development of fertilized eggs were observed. The results showed that the blastocyst rate of mouse fertilized eggs decreased significantly after microinjection. The relative expression levels of Bcl-xl and Bcl-2 genes of Bcl family were detected by Q-PCR using microinjected water 20 h after hCG as control and pEGFP-Ndufa4 expression vector microinjected as experimental group. Bcl-xl and Bcl-2 were used as anti-apoptotic genes. The results showed that overexpression of Ndufa4 gene significantly increased the expression of Bax and Bak in mice, and the relative expression of cyt C protein, which caused apoptosis in mitochondria, was also significantly increased. The relative expression of Bcl-xl and Bcl-2 genes (Bcl-xl and Bcl-2) of Bcl family were detected by Q-PCR using microinjected water 20 h after hCG as control group and SiRNA microinjected with Ndufa4 as experimental group. The results showed that interfering with the expression of Ndufa4 gene in mice resulted in a significant increase in the relative expression of Bax. The overexpression or interference of Ndufa4 might affect the expression of apoptosis factors and eventually lead to apoptosis in fertilized eggs.
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q68

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本文編號：2146994