【摘要】：假單性結(jié)實型無核葡萄的胚珠經(jīng)過授粉受精,但卻在發(fā)育中途敗育解體,在這一過程中伴隨著細(xì)胞程序性死亡(PCD)。細(xì)胞自噬是蛋白降解的一個重要途徑,在真核生物體內(nèi)非常保守,參與了植物生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答、衰老以及細(xì)胞死亡等諸多過程。迄今為止,自噬基因已經(jīng)在多種植物中展開了研究,但多數(shù)集中于衰老和逆境響應(yīng)等方面,關(guān)于種子形成過程中作用的研究很少。因此本試驗結(jié)合無核葡萄胚珠發(fā)育特性,展開對自噬相關(guān)基因(Au Topha Gy-related gene,ATG)的研究。通過生物信息學(xué)方法鑒定葡萄中的ATG基因,利用RT-PCR技術(shù)探究ATG基因在葡萄不同組織和胚珠發(fā)育過程中的表達(dá)模式。主要取得以下研究成果:1.通過生物信息學(xué)方法,在葡萄基因組中鑒定出33個ATG基因,其蛋白序列長度94到2003個氨基酸不等。不同物種的進(jìn)化分析表明葡萄ATG基因與雙子葉植物擬南芥和煙草親緣關(guān)系更近,與單子葉植物水稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。葡萄ATG基因的聚類分析及基因結(jié)構(gòu)分析顯示具有相同結(jié)構(gòu)的基因親緣關(guān)系更近,表明該基因家族在葡萄基因進(jìn)化過程中比較保守。染色體定位發(fā)現(xiàn)Vv ATG基因分布在葡萄中的18條染色體。同線性分析表明,部分重復(fù)在Vv ATG基因家族的擴增中發(fā)揮了作用,共有17對ATG基因位于葡萄和擬南芥的線性相關(guān)區(qū)域,表明它們可能具有共同的祖先和相似的功能,因此我們根據(jù)已知的擬南芥自噬相關(guān)基因的功能去預(yù)測葡萄基因組中的自噬基因的功能。2.通過半定量PCR對Vv ATG基因進(jìn)行組織表達(dá)模式分析,結(jié)果顯示這些基因在黑比諾葡萄根、莖、葉、花、花蕾、果皮、卷須和胚珠中都有表達(dá),只是表達(dá)水平略有不同,表明自噬在植物發(fā)育過程中具有廣泛的作用。Vv ATG基因在有核品種黑比諾和無核品種無核白的胚珠發(fā)育過程中表達(dá)存在差異,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,大部分Vv ATG基因在無核白中的表達(dá)水平較高,可能暗示著在無核白中自噬相關(guān)活動比較活躍,因此推測自噬可能與無核白胚珠敗育相關(guān)。其中,ATG7是一個類泛素活化酶,在自噬體的形成過程中不可或缺。Vv ATG7基因在無核白中的表達(dá)量明顯高于黑比諾中,在花后20-30天,無核白處于表達(dá)峰值,而在有核品種黑比諾中,該基因表達(dá)呈下調(diào)趨勢。3.本試驗預(yù)測發(fā)現(xiàn)葡萄基因組中有10個蛋白能夠與Vv ATG7相互作用。因此我們從黑比諾葡萄中克隆了Vv ATG7、Vv ATG10和Vv ATG12三個基因,測序結(jié)果顯示它們分別編碼了711、230和94個氨基酸。利用酵母雙雜交技術(shù)證明Vv ATG7蛋白分別與Vv ATG10和Vv ATG12蛋白存在互作。
[Abstract]:The ovule of pseudo-parthenocarpy seedless grape was pollinated and fertilized, but disintegrated in the middle of development, and accompanied by programmed cell death (PCD). Autophagy is an important pathway of protein degradation, which is very conserved in eukaryotes and participates in many processes such as plant growth and development, stress response, senescence and cell death. Up to now, autophagy genes have been studied in a variety of plants, but most of them focus on senescence and stress response, and few studies have been done on the role of seed formation in the process of seed formation. Therefore, the study of autophagy related gene (Au Topha Gy-related gene was carried out based on the characteristics of ovule development in seedless grape. The ATG gene in grape was identified by bioinformatics and the expression pattern of ATG gene in different tissues and ovules was investigated by RT-PCR technique. The main achievements are as follows: 1: 1. By bioinformatics, 33 ATG genes were identified in the grape genome with protein sequences ranging from 94 to 2003 amino acids. The phylogenetic analysis of different species showed that the ATG gene of grape was more closely related to Arabidopsis thaliana and tobacco than to monocotyledonous rice. Cluster analysis and gene structure analysis of grape ATG gene showed that the genetic relationship of the same structure gene was closer, which indicated that the gene family was conservative in the evolution of grape gene. VV ATG gene was found to be located on 18 chromosomes in grape. The same linear analysis showed that partial duplication played a role in the amplification of VV ATG gene family. A total of 17 pairs of ATG genes were located in the linear correlation region between grape and Arabidopsis, indicating that they may have common ancestors and similar functions. Therefore, we predict the function of autophagy gene in grape genome based on the function of Arabidopsis thaliana autophagy related gene. The expression patterns of VV ATG genes in Pinot Noir grape roots, stems, leaves, buds, pericarp, tendrils and ovules were analyzed by semi-quantitative PCR. The results indicated that autophagy had a wide function in plant development. Vv ATG gene was expressed differently in the ovule development of Pinot Noir, a nucleated variety, and denuclearized variety, and the results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that there was a significant difference in the expression of Vv ATG gene in the ovule of Pinot Noir. The high expression level of VV ATG gene in denuclearized white may suggest that autophagy is more active in denuclearized white, so it is speculated that autophagy may be related to ovule abortion of denuclearized ovules. ATG7 is a Ubiquitin activator-like enzyme, and the expression of .Vv ATG7 gene in denuclearization is significantly higher than that in Pinot Noir during autophagy formation. The expression peak in denuclearized Pinot Noir is 20 to 30 days after anthesis, while in Pinot Noir, a nucleated variety, ATG7 is expressed at a peak level at 20 to 30 days after anthesis. The expression of the gene was down-regulated. This study predicted that 10 proteins in the grape genome could interact with VV ATG7. Therefore, we cloned Vv ATG7 VV ATG10 and VV ATG12 from Pinot Noir grape. The sequencing results showed that they encoded 711230 and 94 amino acids, respectively. The interaction of VV ATG7 protein with VV ATG10 and VV ATG12 proteins was proved by yeast two hybrid technique.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S663.1

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本文編號：2141159