【摘要】：骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族中重要的成員之一,是原始卵泡和卵母細(xì)胞生存的必需因子,與哺乳動(dòng)物的繁殖性能密切相關(guān)。目前關(guān)于豬BMP4基因的研究較少,其多態(tài)性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序技術(shù)獲得蘇淮豬和梅山豬BMP4基因組序列,通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)其基因組特征和序列特征進(jìn)行分析:采用池DNA測(cè)序技術(shù)篩選蘇淮豬和梅山豬BMP4基因SNP位點(diǎn),采用AS-PCR對(duì)蘇淮豬和梅山豬群體BMP4基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性;采用RT-PCR技術(shù)分析了豬BMP4基因的組織表達(dá)特征,并將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1中,構(gòu)建豬BMP4基因過(guò)表達(dá)載體。研究結(jié)果為揭示豬BMP4基因特征和生物學(xué)功能提供參考。全文結(jié)果如下:1、豬BMP4基因克隆與序列分析通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序獲得了蘇淮豬和梅山豬7147bp的BMP4基因組序列序列,兩者核苷酸序列的一致性為98.63%。電子染色體定位發(fā)現(xiàn)豬BMP4基因定位在豬1號(hào)染色體上,位于203773 kb～203781 kb之間�；蚪M結(jié)構(gòu)分析豬BMP4基因由4個(gè)外顯子和3內(nèi)含子組成。在蘇淮豬和梅山豬BMP4基因5'端-1051～-801nt處發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的啟動(dòng)子區(qū),含有HEN1、STAT1、AP4等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),但未發(fā)現(xiàn)真核生物啟動(dòng)子典型的TATA框和CAAT框。蘇淮豬和梅山豬BMP4基因3'-UTR區(qū)序列全長(zhǎng)為267bp,同源性為100%,含有AC重復(fù)序列、加尾信號(hào)、polyA結(jié)構(gòu)和保守的ARE等。蘇淮豬和梅山豬BMP4基因編碼區(qū)僅由2個(gè)外顯子(外顯子3和4)構(gòu)成,序列全長(zhǎng)1230 bp,編碼409個(gè)氨基酸殘基,兩者核苷酸和氨基酸序列一致性均為100%,與哺乳動(dòng)物其它物種的一致性分別在91%和97%以上;與其它哺乳動(dòng)物一樣,蘇淮豬和梅山豬BMP4蛋白也含有典型的TGF-β前肽和TGF-β樣結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明蘇淮豬和梅山豬BMP4基因與其它哺乳動(dòng)物在基因組結(jié)構(gòu)、序列、蛋白結(jié)構(gòu)等具有較高的保守性。2、豬BMP4基因3'UTR多態(tài)性分析采用池DNA測(cè)序技術(shù)在蘇淮豬和梅山豬BMP4基因3'UTR 20nt處發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP,堿基由G突變?yōu)镃,并將其命名為*20GC。利用建立的AS-PCR方法對(duì)蘇淮豬和梅山豬群體BMP4基因*20GC位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果在蘇淮豬和梅山豬群體中共檢測(cè)到GG、GC和CC等3種基因型。在蘇淮豬群體中,GG型和G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因,頻率分別為為0.815和0.887,而在高繁殖力豬種梅山豬中則相反,CC型和C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因,頻率分別為為0.667和0.770。生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)豬BMP4基因*20GC突變導(dǎo)致miR-7135結(jié)合位點(diǎn)的改變,因此本文構(gòu)建了含有該多態(tài)位點(diǎn)的2種熒光素酶表達(dá)載體(pmirGLO-G和pmirGLO-C),與miR-7135mimics共轉(zhuǎn)293細(xì)胞,熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)不同熒光素酶表達(dá)載體活性無(wú)顯著差異,說(shuō)明BMP4基因*20GC突變可能不是通過(guò)影響miR-7135與之結(jié)合而發(fā)揮作用。研究結(jié)果表明BMP4基因*20GC位點(diǎn)多態(tài)性可能與豬繁殖性能有關(guān)。3、蘇淮豬BMP4基因組織表達(dá)特征與真核表達(dá)載體構(gòu)建利用RT-PCR方法對(duì)蘇淮豬BMP4基因組織表達(dá)特征進(jìn)行分析,結(jié)果顯示BMP4基因在蘇淮豬心臟、肌肉、卵巢、肝臟、腎臟、脾臟6種組織中均有表達(dá),其中在心臟、肌肉、卵巢和腎臟組織中高表達(dá),而在肝臟和脾臟組織中低表達(dá)。將豬BMP4基因編碼區(qū)克隆入pcDNA3.1載體中,構(gòu)建BMP4基因真核表達(dá)載體,酶切鑒定和質(zhì)粒測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)連接到載體中的目的片段序列完全正確,說(shuō)明豬BMP4基因真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,并命名為pcDNA3.1-BMP4。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP4轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞,Westerm blot分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP4組的顆粒細(xì)胞23KD處出現(xiàn)明顯BMP4蛋白條帶,BMP4蛋白表達(dá)水平極顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明pcDNA3.1-BMP4重組質(zhì)�？稍谪i卵巢顆粒細(xì)胞中能夠高效表達(dá),為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein 4 (BMP4) is one of the important members of the transforming growth factor beta (TGF- beta) superfamily. It is an essential factor for the survival of primitive follicles and oocytes. It is closely related to the reproductive performance of mammals. At present, there are few studies on the BMP4 gene of pigs, and the study of its polymorphism has not been reported. This study was amplified and cloned by PCR. The sequence of BMP4 genome of Suai Huai pig and Meishan pig was obtained by sequencing technology. The genomic characteristics and sequence characteristics were analyzed by bioinformatics methods: using pool DNA sequencing technology to screen the SNP loci of the BMP4 gene of Suai Huai pigs and Meishan pigs, and the SNP polymorphism of BMP4 gene in Suai and Huaihe pigs and Meishan pigs by AS-PCR. The tissue expression characteristics of the porcine BMP4 gene were analyzed and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 to construct the overexpression vector of porcine BMP4 gene. The results can provide reference for the characterization and biological function of the porcine BMP4 gene. The full text results are as follows: 1, the cloning and sequence analysis of porcine BMP4 gene obtained the Suai Huai pig by PCR amplification and cloning sequencing. And the sequence of BMP4 genome of Meishan pig 7147bp, the consistency of the nucleotide sequence of the two nucleotide sequences is that the porcine BMP4 gene is located on the porcine chromosome 1, located between 203773 KB and 203781 KB. The genome structure analysis of the pig BMP4 gene consists of 4 exons and 3 introns. In the Suai and Huaihe pigs and the Meishan pig BMP4 gene 5' A potential promoter region was found at the end of -1051 to -801nt, containing HEN1, STAT1, AP4 and other transcription factor binding sites, but the typical TATA frame and CAAT frame of the eukaryotic promoter were not found. The 3'-UTR region sequence of the BMP4 gene of Suai Huai pig and Meishan pig was 267bp and the homology was 100%, containing AC repeat sequence, tail signal, polyA structure and conservatively. E and so on. The BMP4 gene coding region of the Suai and Meishan pigs is composed of 2 exons (exons 3 and 4), with a full length of 1230 BP and 409 amino acid residues. The consistency of both nucleotide and amino acid sequences is 100%, and the consistency between the other species of mammals is 91% and 97%, respectively, and the same as other mammals, Suai Huai pigs and Meishan. The porcine BMP4 protein also contains typical TGF- beta propeptide and TGF- beta like domain. The results show that the BMP4 gene of Suai and Meishan pigs and other mammals have high conserved.2 in genome structure, sequence, protein structure and so on. The 3'UTR polymorphism analysis of pig BMP4 gene uses pool DNA sequencing technology in the BMP4 gene 3'UTR 20nt in Suai and Huaihe pigs and Meishan pigs A SNP was found, the base was mutated from G to C, and it was named *20GC. using the AS-PCR method established by *20GC. to detect the BMP4 gene *20GC polymorphism of the Suai Huai pig and Meishan pig population. The results showed that the 3 genotypes of GG, GC and CC were detected in Suai Huai pig and Meishan pig population. The frequencies of genotypes and dominant alleles were 0.815 and 0.887 respectively, while in the high fecundity porcine Meishan pigs, the CC and C alleles were dominant genotypes and dominant alleles. The frequency of the 0.667 and 0.770. bioinformatics methods predicted the change of miR-7135 binding sites caused by *20GC mutations in porcine BMP4. In this paper, 2 kinds of luciferase expression vectors (pmirGLO-G and pmirGLO-C) containing the polymorphic loci were constructed, and 293 cells were converted to miR-7135mimics. The activity analysis of luciferase showed that there was no significant difference in the activity of different luciferase expression vectors. It was suggested that the *20GC mutation of the BMP4 gene may not play a role by affecting the combination of miR-7135. The results show that the polymorphism of the BMP4 gene *20GC loci may be related to the reproductive performance of the pig.3, the expression characteristics of the BMP4 gene in Suai pig and the eukaryotic expression vector construction and use of RT-PCR method to analyze the expression characteristics of the BMP4 gene in the Suai Huai pig. The results show that the BMP4 gene is in the 6 tissues of the pig heart, muscle, ovary, liver, kidney and spleen of the Suai Huaihe pig. High expression in heart, muscles, ovaries and kidneys, and low expression in the liver and spleen tissues. The porcine BMP4 gene coding region was cloned into the pcDNA3.1 vector to construct the eukaryotic expression vector of the BMP4 gene. The sequence of enzyme digestion and plasmid sequencing was completely correct, and the sequence of the target fragments found in the carrier was completely correct. The eukaryotic expression vector of porcine BMP4 gene was successfully constructed, and the recombinant plasmid pcDNA3.1-BMP4 was named as pcDNA3.1-BMP4. to transfect the cultured porcine follicle granulosa cells in vitro. The Westerm blot analysis found that the 23KD of the recombinant plasmid pcDNA3.1-BMP4 group showed obvious BMP4 protein bands at 23KD, and the expression level of BMP4 protein was significantly higher than that of the control group. It is indicated that pcDNA3.1-BMP4 recombinant plasmid can be highly expressed in porcine ovarian granulosa cells, which lays a foundation for further study of its function.
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：2134223