【摘要】：自從第一例轉(zhuǎn)基因大豆成功轉(zhuǎn)化以來,轉(zhuǎn)基因大豆品種和種植面積日漸增加,其安全性及對(duì)環(huán)境的影響等問題已變成了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。因此,為了保障消費(fèi)者的權(quán)益,轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)已成為轉(zhuǎn)基因研究的必要環(huán)節(jié),發(fā)展快速、靈敏、高通量、自動(dòng)化的新型檢測(cè)方法,已成為國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法的熱點(diǎn),對(duì)推進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展,保障轉(zhuǎn)基因大豆的安全監(jiān)管和維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定具有極其重要的意義。本論文以量子點(diǎn)為信號(hào)材料,構(gòu)建光電、熒光生物傳感器,并將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆 35S 啟動(dòng)子(Promoter of cauliflower mosaic virus 35s,P35S)或(和)NOS終止子(Terminatomopalinesynthase,TNOS)的檢測(cè)中,并通過所設(shè)計(jì)方法之間的比較,選擇最優(yōu)設(shè)計(jì)方案,結(jié)合機(jī)器視覺技術(shù)開發(fā)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的裝置,以達(dá)到快速、靈敏、高通量、自動(dòng)化檢測(cè)的目的。具體研究?jī)?nèi)容如下:1、以制備的金納米粒子-還原氧化石墨烯(Gold nanoparticles-reduce graphene oxide, AuNPs-rGO)納米功能材料為基底材料,連接帶有-SH的DNA探針(probel),制得固定探針;采用靜電吸附法將大量的CdTe量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)均勻的負(fù)載在SiO2表面,形成核-殼結(jié)構(gòu)SiO2@CdTe納米球,然后通過酰胺反應(yīng)與-NH2修飾的DNA探針(probe2)連接,制得捕獲探針;固定探針、捕獲探針分別與P35S目標(biāo)DNA的兩端特異性雜交,形成“三明治”結(jié)構(gòu)的光電化學(xué)生物傳感器,應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆中P35S的檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn),SiO2@CdTe納米球的光電流信號(hào)是CdTe QDs的2.5倍,rGO-AuNPs具有大的比表面積和出色的導(dǎo)電性能,該傳感器以核-殼結(jié)構(gòu)的SiO2@CdTe納米球和rGO-AuNPs納米復(fù)合物作為雙重信號(hào)放大策略,DNA探針作為識(shí)別元件,具有良好的選擇性、靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。在優(yōu)化條件下,P35S的濃度與該傳感器的光電流強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性,線性范圍為0.1 pM～500 pM,檢出限為0.05 pM (S/N=3),并用于實(shí)際轉(zhuǎn)基因大豆樣品檢測(cè),為光電化學(xué)傳感技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的應(yīng)用提供了新思路。2、采用常壓水熱法制備熒光性能優(yōu)良、表面富含-COOH基團(tuán)的氮雜石墨烯量子點(diǎn)(Nitrogen-doped graphene quantum dots,NGQDs)作為信號(hào)分子,通過酰胺反應(yīng)與帶有-NH2的DNA探針(probel)連接,制得捕獲探針;所制備的粒徑均勻的銀納米粒子(Silver nanoparticles,AgNPs)通過Ag-S鍵與帶有-SH基團(tuán)的DNA探針(probe2)結(jié)合,制得固定探針;固定探針、捕獲探針分別與P35S目標(biāo)DNA的兩端進(jìn)行特異性雜交,從而拉近NGQDs-AgNPs的距離,促使熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的發(fā)生,構(gòu)成均相熒光生物傳感體系。研究發(fā)現(xiàn),NGQDs的熒光發(fā)射光譜和AgNPs的紫外吸收光譜具有大幅重疊的特性,在優(yōu)化條件下,P35S的濃度與NGQDs的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的負(fù)相關(guān)性,線性范圍為0.1nM～500nM,檢出限為0.03nM(S/N=3)。該熒光生物傳感體系的檢測(cè)過程在均相溶液中進(jìn)行,無需分離,操作步驟簡(jiǎn)單,且具有良好的選擇性和重現(xiàn)性,并成功將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè),為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)提供了一種有效途徑。3、采用改進(jìn)的Stober法分別制備SiO2納米球內(nèi)部包裹綠色CdTe QDs(green QDs,gQDs)、紅色 CdTe QDs (red QDs,rQDs)的核-殼結(jié)構(gòu) gQDs@SiO2、rQDs@SiO2納米復(fù)合材料,通過靜電吸附法在其表面分別吸附大量的gQDs、rQDs,從而得到熒光性能優(yōu)良的gQDs@SiO2@gQDs、rQDs@SiO2@rQDs熒光微球;制備的熒光微球gQDs@SiO2@gQDs、rQDs@SiO2@rQDs通過酰胺反應(yīng)分別與-NH2修飾的TNOS捕獲探針(CaptureprobesofTNOS,CT)和P35S捕獲探針(CaptureprobesofP35S,CP)共價(jià)結(jié)合,制得 gQDs@SiO2@gQDs-CT 和rQDs@SiO2@rQDs-CP;以具有優(yōu)良磁性的核-殼型金磁微粒(Fe3O4@Au magnetic beads, MBs)為磁控材料,通過Au-S鍵分別與修飾-SH的TNOS固定探針(Fixing probes of TNOS, FT)、P35S 固定探針(Fixing probes of P35S,FP)結(jié)合,制得MBs-FT 和 MBs-FP; gQDs@SiO2@gQDs-CT、MBs-FT 分別與 TNOS 的兩端特異性雜交;rQDs@SiO2@rQDs-CP、MBs-FP分別與P35S的兩端特異性雜交;利用MBs的磁性對(duì)目標(biāo)DNA所連接上的熒光微球進(jìn)行分離,隨后檢測(cè)剩余溶液的熒光強(qiáng)度,構(gòu)建了磁控生物傳感體系。在優(yōu)化條件下,TNOS和P35S的濃度與所剩溶液中的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的負(fù)相關(guān)性。線性范圍分別為0.2 nM～800 nM和0.1nM～800nM,檢出限分別為0.07nM和0.04nM(S/N=3)。成功將構(gòu)建的磁控生物傳感體系用于TNOS和P35S的同時(shí)檢測(cè),為轉(zhuǎn)基因多目標(biāo)檢測(cè)提供了新思路。4、通過控制合成時(shí)間,分別制備發(fā)射綠色熒光的gQDs和發(fā)射紅色熒光的rQDs; gQDs、rQDs分別通過酰胺反應(yīng)與-NH2修飾的TNOS捕獲探針(CT)和P35S捕獲探針(CP)共價(jià)結(jié)合,制得gQDs-CT和rQDs-CP納米生物探針(熒光信號(hào)“開”);MWCNTs@GONRs同時(shí)作為兩種納米生物探針的熒光淬滅劑,使其熒光同時(shí)淬滅(熒光信號(hào)“關(guān)”);向所構(gòu)建的傳感體系中同時(shí)加入目標(biāo)物TNOS和P35S時(shí),通過目標(biāo)物和對(duì)應(yīng)的納米生物探針之間DNA特異性雜交互補(bǔ)配對(duì),形成雙鏈DNA,從而使納米生物探針從MWCNTs@GONRs表面脫落,發(fā)生熒光恢復(fù)(熒光信號(hào)“開”)。在優(yōu)化條件下,TNOS和P35S的濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性。線性范圍分別為1.5 nM～1000 nM和1.2 nM～900 nM,檢出限分別為0.5 nM和0.35 nM (S/N=3)。該傳感體系具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,為轉(zhuǎn)基因多重目標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。5、通過以上幾種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的比較,搭建了基于兩種顏色CdTe QDs和機(jī)器視覺技術(shù)的轉(zhuǎn)基因TNOS和P35S檢測(cè)裝置。采用熒光“開-關(guān)-開”效應(yīng)的生物傳感體系對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行顯色,通過圖像信息采集、圖像分割、圖像特征數(shù)據(jù)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)TNOS和P35S的快速檢測(cè),而且操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化、智能化,省去了繁瑣的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理過程,其準(zhǔn)確度高、時(shí)效性好,是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的一個(gè)重要突破。
[Abstract]:In order to protect consumers ' rights and interests , the detection of transgenic soybean has become the focus of transgenic research . In this paper , the fluorescence emission spectrum of NGQDs and the fluorescence intensity of NGQDs were studied . The results showed that the fluorescence emission spectrum of NGQDs and the fluorescence intensity of NGQDs showed a good negative correlation . The detection limit of the fluorescence emission spectrum was 0.1nM ~ 500 nM , the detection limit was 0.03 nM ( S / N = 3 ) . The fluorescence intensity of TNOS and P35S capture probes ( fluorescence signal " on " ) was obtained . The results showed that the fluorescence intensity of the fluorescence microballoons was 0.2nM ~ 800 nM and 0.1nM ~ 800 nM , respectively . The detection limits were 0 . 2 nM ~ 800 nM and 0.1 nM ~ 800 nM , respectively . The detection limit was 0 . 07nM and 0 . 04nM ( S / N = 3 ) . The method can realize the rapid detection of TNOS and P35S , and the operation is simple , automatic and intelligent , and the tedious experiment data processing process is saved , the accuracy is high , the timeliness is good , and is an important breakthrough of transgenic detection .
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TP212.3;TS214.2

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本文編號(hào)：2131033