本文選題：纖維素酶 + 柄藍(lán)狀菌��； 參考：《武漢工程大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：柄藍(lán)狀菌EMM是本實(shí)驗(yàn)室從原始菌OPC4誘變而來的一株高產(chǎn)纖維素酶菌,由于其超高的蛋白分泌量和酶活穩(wěn)定性,在產(chǎn)纖維素酶的生產(chǎn)方面表現(xiàn)出很好的工業(yè)化前景。但其β-木糖苷酶的酶活過低,嚴(yán)重影響降解木質(zhì)纖維素的綜合能力,所以本文通過基因工程的方法對(duì)其進(jìn)行改造。由于采用PEG—CaCl2的轉(zhuǎn)化方法,其重點(diǎn)在于原生質(zhì)的制備與再生。從制備材料,菌齡,滲透壓穩(wěn)定劑,酶的種類,酶的濃度,酶解時(shí)間及再生方式對(duì)柄藍(lán)狀菌EMM原生質(zhì)的制備與再生進(jìn)行優(yōu)化。其最適宜的原生質(zhì)的制備與再生條件為:以菌齡為48小時(shí)的菌絲為材料,在滲透壓穩(wěn)定劑1.2MMgSO_4的條件下,以50mg/mL的裂解酶,溫度30度,酶解3h,以先液體培養(yǎng)基孵化過夜再混合倒板的再生方式再生。原生質(zhì)體的釋放量可達(dá)8.73±0.8×10~8個(gè)/g,再生率可達(dá)17.7±1.9%。里氏木霉作為纖維素酶的商業(yè)生產(chǎn)菌株,其β-木糖苷酶活較高。從里氏木霉T.reesei Rut-C30和柄藍(lán)狀菌EMM里分別克隆出β-木糖苷酶基因,通過同源重組的方式,用添加了PCBH啟動(dòng)子和TCBH終止子的C30β-木糖苷酶基因替換掉原來EMM的β-木糖苷酶基因,來達(dá)到提高EMMβ-木糖苷酶活的目的。轉(zhuǎn)化后在含有潮霉素B的PDB培養(yǎng)液連續(xù)傳代3次后,涂布在潮霉素B平板上篩選得到37個(gè)轉(zhuǎn)化子,經(jīng)PCR驗(yàn)證10個(gè)為hph陽性轉(zhuǎn)化子,用同源同組引物鑒定,其中2個(gè)為同源同組轉(zhuǎn)化子,其他為隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子。10個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子與原始EMM同時(shí)發(fā)酵取第7天最大酶活檢測(cè),對(duì)比發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)化子的濾紙酶活FPA均高于EMM,最高達(dá)60%,然而β-木糖苷酶活幾乎幾乎沒有差距。由于以潮霉素B為標(biāo)記基因選擇強(qiáng)度和穩(wěn)定性不高,導(dǎo)致需要通過含潮霉素B液體培養(yǎng)基傳代來篩選陽性轉(zhuǎn)化子,耗時(shí)過多效率不高。通過UV誘變的方法,在1.5g/mL 5-FOA的篩選壓力下,從EMM誘變得到一株尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型EMU6。從OPC4的基因組里克隆出2553bp的pyrF基因,通過NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn),pyrF為編碼乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的基因,影響尿嘧啶的合成。通過測(cè)序?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn),尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型EMU6的pyrF基因在1160bp處有一個(gè)核苷酸缺失。為了確認(rèn)pyrF可以作為一個(gè)標(biāo)記基因,將帶有pyrF的質(zhì)粒pGEF2通過PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入EMU6中。通過PCR分析,pyrF已經(jīng)整合到EMU6的基因組當(dāng)中,使EMM重新獲得了合成尿嘧啶的能力。從以上結(jié)果可以的出結(jié)論,基于pyrF作為標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)構(gòu)建成功。為了構(gòu)建一個(gè)可以重復(fù)利用的pyrF標(biāo)記基因,在pyrF基因的一側(cè)添加了一段490bp的正向重復(fù)序列,這樣在利用pyrF篩選出轉(zhuǎn)化子后,在5-FOA的選擇壓力下,一側(cè)的正向重復(fù)序列與pyrF中的重復(fù)部分發(fā)生同源重組而導(dǎo)致pyrF標(biāo)記自動(dòng)刪除。通過這種策略可以達(dá)到pyrF標(biāo)記基因重復(fù)使用的目的,使后面利用EMM作為細(xì)胞工廠表達(dá)外源基因的工作成為可能。
[Abstract]:Blue stalk bacteria EMM is a cellulase producing strain which was induced from the original strain OPC4 in our laboratory. Because of its high protein secretion and enzyme activity stability, EMM has a good prospect of industrialization in the production of cellulase. However, the enzyme activity of 尾 -xylosidase was too low, which seriously affected the comprehensive ability of degradation of lignocellulose. Therefore, the genetic engineering method was used to modify the 尾 -xylosidase. Due to PEG-CaCl _ 2 transformation, the emphasis is on the preparation and regeneration of protoplasm. The preparation and regeneration of EMM protoplasm were optimized from preparation materials, bacterial age, osmotic pressure stabilizer, enzyme type, enzyme concentration, enzymatic hydrolysis time and regeneration method. The optimum conditions for protoplast preparation and regeneration were as follows: the mycelium of 48 hours was used as the material, the osmotic pressure stabilizer was 1.2 MMgSO4, the lyase was 50 mg / mL, the temperature was 30 degrees. After 3 h enzymatic hydrolysis, regeneration was carried out in liquid medium incubated overnight and then mixed with inverted plate. The release of protoplasts was 8.73 鹵0.8 脳 10 ~ 8 / g, and the regeneration rate was 17.7 鹵1.9. Trichoderma rii, as a commercial cellulase producing strain, has high 尾-xylosidase activity. The 尾 -xylosidase gene was cloned from T. reesei Rut-C30 and E. solanum EMM, respectively. By homologous recombination, the 尾 -xylosidase gene was replaced by the C30 尾 -xylosidase gene which added PCBH promoter and TCBH Terminator. To increase the activity of EMM 尾-xylosidase. After transformation, 37 transformants were screened on hygromycin B plate after three successive passages in the culture medium containing hygromycin B. 10 transformants were identified as hph positive transformants by PCR, and identified by homologous primers. Two of them were homologous transformants, the other were randomly inserted transformants. Ten positive transformants were fermented with the original EMM at the same time to detect the maximum enzyme activity on the 7th day. The results showed that the filter paper enzyme activity of the transformants was higher than that of EMMs, and the highest was 60%. However, there was almost no difference in 尾 -xylosidase activity. Because the selection intensity and stability of hygromycin B as marker gene is not high, it is necessary to screen positive transformants by subculture of hygromycin B liquid medium, and the time consuming is not high. Under the screening pressure of 1.5 g / mL 5-FOA, a uracil nutrition deficient strain EMU6 was obtained from EMM by UV mutagenesis. The pyrF gene of 2553bp was cloned from the genome of OPC4. By NCBI comparison, it was found that pyrF was a gene encoding whey acid phosphate ribonyltransferase, which affected the synthesis of uracil. By sequencing comparison, it was found that the pyrF gene of EMU6 had a nucleotide deletion at 1160bp. In order to confirm that pyrF can be used as a marker gene, the plasmid pGEF2 containing pyrF was transferred into EMU6 by PEG mediated method. PCR analysis showed that pyrF had been integrated into EMU6 genome, and EMM was able to synthesize uracil. From the above results, we can conclude that the transformation system based on pyrF as a marker gene has been successfully constructed. In order to construct a reusable pyrF marker gene, a forward repeat sequence of 490bp was added to the side of the pyrF gene, so that after screening out the transformant using pyrF, the selection pressure of 5-FOA was applied. The homologous recombination of the forward repeats on one side with the repeats in pyrF leads to the automatic deletion of pyrF tags. This strategy can achieve the purpose of repeated use of pyrF marker genes and make it possible to express foreign genes by using EMM as a cell factory.
【學(xué)位授予單位】：武漢工程大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TQ925

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本文編號(hào)：2103875