發(fā)布時(shí)間：2018-06-30 19:39

  本文選題：白血病 + 多藥耐藥　； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的課題組前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出的核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin,NPM,B23)在耐藥的急性白血病患者中高表達(dá),推測該蛋白的高表達(dá)可能與白血病的耐藥機(jī)制相關(guān)。本課題旨在構(gòu)建NPM基因穩(wěn)定沉默的急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系CA46及Jurkat細(xì)胞模型,研究沉默NPM后對CA46及Jurkat細(xì)胞株增殖、凋亡、藥物敏感性等的影響,初步探討NPM基因沉默對白血病細(xì)胞藥物敏感性影響的可能機(jī)制。方法1.設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對NPM的小干擾RNA載體,包裝慢病毒,分別轉(zhuǎn)染CA46及Jurkat細(xì)胞,并檢測其轉(zhuǎn)染效率及干擾效率。2.應(yīng)用MTT法和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CA46及Jurkat細(xì)胞增殖變化。3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡,Western blot法研究凋亡相關(guān)蛋白的變化。4.應(yīng)用MTT法檢測NPM基因沉默后對白血病細(xì)胞阿霉素的敏感性(IC50),并用Western blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)法檢測耐藥相關(guān)蛋白及m RNA的表達(dá)水平。5.Western blot法研究若干信號通路的變化以探討細(xì)胞凋亡及耐藥的可能機(jī)制。6.本文中以CON、NC、KD分別表示CA46及Jurkat細(xì)胞的空白對照組、插入無關(guān)序列的陰性對照組和NPM基因敲減實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果1.成功構(gòu)建NPM基因沉默的慢病毒表達(dá)載體(NPM-RNAi-LV),并成功構(gòu)建 NPM基因穩(wěn)定沉默的CA46和Jurkat細(xì)胞株。2.NPM基因沉默能夠?qū)е翪A46及Jurkat細(xì)胞增殖減慢,細(xì)胞克隆形成能力受抑制。3.NPM基因沉默能夠誘導(dǎo)CA46及Jurkat細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加,其中caspase-3前體下調(diào),剪切體上調(diào);PARP剪切體上調(diào);Bcl-2抗凋亡蛋白下調(diào);CA46/KD組細(xì)胞中caspase-9剪切體上調(diào);Jurkat/KD組細(xì)胞中caspase-9前體下調(diào)。4.NPM基因沉默提高CA46及Jurkat細(xì)胞對阿霉素的敏感性,抑制NPM表達(dá)后,CA46細(xì)胞對阿霉素的IC50值由轉(zhuǎn)染前的0.526±0.138μg/ml下降至轉(zhuǎn)染后的0.099±0.025μg/ml,敏感性提高5.313倍;Jurkat細(xì)胞對阿霉素的IC50值由轉(zhuǎn)染前的0.528±0.098μg/ml下降至轉(zhuǎn)染后的0.223±0.031μg/ml,敏感性提高2.368倍。5.NPM基因沉默后,BCRP、LRP表達(dá)下調(diào),CA46和Jurkat細(xì)胞中AKT/m TOR的信號分子的活化受到抑制,c-Myc、GST-π基因的表達(dá)下調(diào)。Jurkat細(xì)胞中還出現(xiàn)p-ERK信號分子下調(diào)。結(jié)論RNA干擾成功下調(diào)CA46/Jurkat細(xì)胞株中NPM基因的表達(dá),并證實(shí)NPM基因沉默可以導(dǎo)致CA46/Jurkat細(xì)胞增殖減慢,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加,caspase家族與Bcl-2家族參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。沉默NPM基因能夠提高CA46/Jurkat細(xì)胞對阿霉素的敏感性,下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白BCRP、LRP的表達(dá),可能與PI3K/AKT/m TOR信號通路的受抑制和c-Myc、GST-π基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。在Jurkat細(xì)胞中除上述作用機(jī)制外,還可能與p-ERK信號分子下調(diào)有關(guān)。
[Abstract]:Objective the high expression of Nucleophosmin (NPM, B23), which was screened by proteomics technology in the early stage, is highly expressed in the drug resistant acute leukemia patients. It is presumed that the high expression of the protein may be related to the mechanism of drug resistance in leukemia. The aim of this study is to construct a stable and silent NPM gene of acute lymphoblastic leukemia cell line CA46. And Jurkat cell model, the effects of silent NPM on the proliferation, apoptosis and drug sensitivity of CA46 and Jurkat cell lines were investigated. The possible mechanism of NPM gene silencing on the drug sensitivity of leukemia cells was preliminarily discussed. Method 1. the small interference RNA vector for NPM was designed and constructed, the lentivirus was packaged, CA46 and Jurkat cells were transfected respectively, and the detection of CA46 and Jurkat cells respectively. Test the transfection efficiency and interference efficiency.2. MTT method and cell clone formation test to detect CA46 and Jurkat cell proliferation changes.3. application flow cytometry analysis of apoptosis, Western blot method to study the changes of apoptosis related proteins.4. application MTT method to detect the sensitivity of adriamycin in leukemic cells after NPM gene silencing (IC50), and Weste RN blot, real-time fluorescence quantitative PCR technique was used to detect the expression level of drug-resistant related proteins and m RNA by.5.Western blot method to study the changes of several signaling pathways to explore the possible mechanism of cell apoptosis and drug resistance.6. in this paper, CON, NC, KD, respectively, expressed in the group of CA46 and blank cells, the negative control group inserted into the independent sequence and the negative control group, respectively. The result of gene knockout experimental group. Results 1. the NPM gene silenced Lentivirus Expression Vector (NPM-RNAi-LV) was successfully constructed, and the successful construction of the silent CA46 and.2.NPM gene silencing of the NPM gene could lead to the proliferation and decrease of CA46 and Jurkat cells, and the cell clone formation ability was inhibited by the suppression of.3.NPM gene silencing, which could induce CA46 and Jurkat fine. The apoptosis was increased, in which the caspase-3 precursor was down, the shear body was up regulation, the PARP shear body was up regulated, the Bcl-2 anti apoptotic protein was down regulated, the caspase-9 shear body was up regulated in the CA46/KD group, and the caspase-9 precursor in the Jurkat/KD group reduced the.4.NPM gene silencing to increase the CA46 and Jurkat cell sensitivity to doxorubicin, and the CA46 cells were inhibited after the NPM expression. The IC50 value of adriamycin decreased from 0.526 + 0.138 g/ml before transfection to 0.099 + 0.025 mu g/ml after transfection, and the sensitivity was increased by 5.313 times. The IC50 value of adriamycin in Jurkat cells decreased from 0.528 + 0.098 Mu before transfection to 0.223 + 0.031 g/ml after transfection, and the sensitivity was increased by 2.368 times.5.NPM gene, BCRP, LRP expression was down, CA46 and Jur The activation of signal molecules of AKT/m TOR in Kat cells was inhibited, and the expression of c-Myc, GST- PI gene was downregulated in.Jurkat cells. Conclusion RNA interference successfully downregulated the expression of NPM gene in CA46/Jurkat cell lines, and confirmed that NPM gene silencing could lead to the proliferation and decrease of CA46 cells and induce cell apoptosis. The caspase family and the Bcl-2 family are involved in the regulation of apoptosis. The silence of NPM gene can improve the sensitivity of CA46/Jurkat cells to adriamycin, and the expression of BCRP, LRP, may be related to the inhibition of PI3K/AKT/m TOR signaling pathway and the regulation of c-Myc, GST- PI gene expression. It may also be related to the downregulation of p-ERK signal molecules.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71

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本文編號：2086617