發(fā)布時(shí)間：2018-06-27 23:59

  本文選題：棉鈴蟲(chóng) + cry2Ah2��； 參考：《新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera Hubner)屬于鱗翅目夜蛾科,在世界各地廣泛分布,是棉花生產(chǎn)最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一。20世紀(jì)80、90年代,棉鈴蟲(chóng)在全世界主要產(chǎn)棉區(qū)大面積暴發(fā),導(dǎo)致棉花嚴(yán)重減產(chǎn),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過(guò)20多年的研究和生產(chǎn)應(yīng)用,轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉取得了巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。然而隨著抗蟲(chóng)棉的大面積種植,在高生態(tài)選擇壓作用下,棉鈴蟲(chóng)對(duì)抗蟲(chóng)基因產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸增加。通過(guò)對(duì)Bt蛋白的殺蟲(chóng)機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)單一Bt基因棉花的大面積推廣應(yīng)用容易導(dǎo)致昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。因此,通過(guò)發(fā)掘不同殺蟲(chóng)機(jī)理的Bt基因,創(chuàng)制含有不同殺蟲(chóng)機(jī)理復(fù)合抗蟲(chóng)棉花新材料,已經(jīng)成為當(dāng)前抗蟲(chóng)棉花基因工程的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)復(fù)合抗蟲(chóng)基因棉花,不僅可以提高殺蟲(chóng)效率,而且可有效地避免或延遲昆蟲(chóng)的抗性發(fā)生。cry2Ah2,cry2Ab4,vip3Aa11是從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)中克隆到的3個(gè)新型Bt晶體蛋白殺蟲(chóng)基因。其中Cry2Ah2和Cry2Ab4是在孢子形成期產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal crystal proteins,ICPs),對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲(chóng)具有毒殺功能。Vip3Aa11是一種營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(Vegetative insecticidal proteins,VIPs),對(duì)棉鈴蟲(chóng)、小地老虎等一系列鱗翅目害蟲(chóng)均有較高的毒性作用。本研究依據(jù)棉花遺傳密碼子偏好性,對(duì)cry2Ah2,cry2Ab4,vip3Aa11基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化改造,改造后的三個(gè)基因克隆到pGBI121植物表達(dá)載體,構(gòu)建成pGBI-cry2Ah2(35S::cry2Ah2:Nos)、pGBI-cry2Ab4(35S::cry2Ab4:Nos)和pGBI-vip3Aa11(35S::vip3Aa11:Nos)單基因表達(dá)載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草NC89(Nicotiana tabacum L.)后,分別獲得30株轉(zhuǎn)cry2Ah2基因陽(yáng)性煙草植株,33株轉(zhuǎn)cry2Ab4基因陽(yáng)性煙草植株,40株轉(zhuǎn)vip3Aa11基因陽(yáng)性煙草植株。熒光定量PCR結(jié)果表明,三個(gè)抗蟲(chóng)基因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株均能穩(wěn)定地高水平地表達(dá)外源抗蟲(chóng)基因,我們分別選取了表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern blot檢測(cè),三個(gè)基因已經(jīng)整合到煙草基因組中,其中轉(zhuǎn)cry2Ah2基因煙草進(jìn)一步通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)在蛋白水平驗(yàn)證了其表達(dá)。生物活性檢測(cè)結(jié)果表明,用轉(zhuǎn)cry2Ah2,cry2Ab4,vip3Aa11基因煙草葉片分別飼喂初孵棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng),4天后幼蟲(chóng)校正死亡率分別在86.59%,86.51%和87.70%以上,均達(dá)到高抗水平,其中,轉(zhuǎn)vip3Aa11植株抗蟲(chóng)效果優(yōu)于轉(zhuǎn)cry2Ah2和cry2Ab4植株,轉(zhuǎn)cry2Ah2與cry2Ab4基因植株抗蟲(chóng)水平相當(dāng)。這一結(jié)果表明cry2Ah2,cry2Ab4,vip3Aa11三個(gè)基因?yàn)楝F(xiàn)有抗蟲(chóng)棉的深化研究提供了新的抗性基因源。本研究證實(shí)了3個(gè)基因均可以在模式植物中高水平表達(dá),并使轉(zhuǎn)基因煙草具有高抗蟲(chóng)性,是防治棉鈴蟲(chóng)等害蟲(chóng)的新型候選抗蟲(chóng)基因,可將其轉(zhuǎn)入棉花等作物,用于培育新一代的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物新品種。
[Abstract]:Helicoverpa armigera Hubner, a member of the family Lepidoptera, is widely distributed all over the world. Helicoverpa armigera Hubner is one of the most serious pests in cotton production. In the 1980s and 1990s, Helicoverpa armigera Hubner broke out in the major cotton producing areas of the world, resulting in serious reduction of cotton production. Causing enormous economic losses. After more than 20 years of research and application, transgenic BT transgenic cotton has achieved great ecological and economic benefits. However, with the extensive cultivation of cotton, the risk of resistance to cotton bollworm genes increased gradually under the action of high ecological selective pressure. By studying the insecticidal mechanism of BT protein, it was found that the extensive application of transgenic cotton with single BT gene could lead to insect resistance. Therefore, by exploring BT gene of different insecticidal mechanism and creating new material containing different insecticidal mechanism, it has become a hot spot in genetic engineering of insect-resistant cotton flower. Transgenic cotton with compound insect-resistant gene could not only improve the insecticidal efficiency, but also effectively avoid or delay the occurrence of insect resistance. Cry2Ah2H2Ab4vip3Aa11 is a new BT crystal protein insecticidal gene cloned from Bacillus thuringiensis Bt. Cry2Ah2 and Cry2Ab4 are insecticidal crystal proteinsICPs produced during spore formation. They are toxic to Lepidoptera, Diptera, Coleoptera and many other insects. Vip3Aa11 is a vegetative insecticidal proteinsVIPs. A series of Lepidoptera pests, such as small ground tiger, have high toxicity. Based on the preference of cotton genetic codon, the codon of cry2Ah2Ab4vip3Aa11 gene was optimized and cloned into pGBI121 plant expression vector pGBI121. The single gene expression vector pGBI-2Ah2 (35 S: cry2Ah2: Nos) pGBI-cry2Ab4 (35S: cry2Ab4: Nos) and pGBI-vip3Aa11 (35S: vivip3Aa11Nos) were constructed. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of tobacco NC89 (Nicotiana tabacum L.) After that, 30 cry2Ah2 gene positive tobacco plants, 33 cry2Ab4 gene positive tobacco plants and 40 vip3Aa11 gene positive tobacco plants were obtained. The results of fluorescence quantitative PCR showed that all the transgenic tobacco plants with three insect-resistant genes could express exogenous insect-resistant genes stably at a high level, and the transgenic plants with higher expression level were selected for Southern blot detection. The three genes had been integrated into the tobacco genome, and the transgenic cry2Ah2 gene was further verified by Western blot assay at the protein level. The results of bioactivity test showed that the corrected larval mortality was 86.59% and 87.70% respectively after the leaves of transgenic tobacco with cry2Ah2Ab4vip3Aa11 gene were fed with the newly hatched larvae of Helicoverpa armigera respectively for 4 days. The insect-resistant effect of vip3Aa11 transgenic plants was better than that of cry2Ah2 and cry2Ab4 plants, and the resistance level of transgenic cry2Ah2 and cry2Ab4 transgenic plants was the same. The results showed that the three bases of cry2Ah2 + cry2Ab4vip3Aa11 provided a new resistance gene source because of the further study of the existing insect-resistant cotton. This study confirmed that all three genes can be expressed at high level in model plants, and that transgenic tobacco has high insecticidal resistance. It is a new candidate insect-resistant gene for controlling cotton bollworm and other pests, which can be transferred to cotton and other crops. New varieties of transgenic insecticidal crops used to cultivate a new generation of transgenic insect-resistant crops.
【學(xué)位授予單位】：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S435.62

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本文編號(hào)：2075787