本文選題：瘧疾 + P.bergei　； 參考：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：瘧疾是由原蟲類寄生蟲瘧原蟲感染引起的熱帶疾病,是目前危害人類健康的主要傳染性疾病之一。感染地區(qū)主要分布在撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)以及東南亞。5歲以下的兒童是瘧疾易感人群。感染瘧疾的病人表現(xiàn)出嚴(yán)重貧血、代謝性酸中毒、肺衰竭以及腦瘧等病理特征�？汞懠差愃幬锸悄壳白钣行У目刂坪椭委煰懠驳氖侄�。然而由于耐藥瘧原蟲株的出現(xiàn),尤其在東南亞地區(qū)出現(xiàn)耐青蒿素的瘧原蟲株,使得瘧疾防治工作面臨越來越大的困難,因此,人們寄希望于高保護(hù)效率的瘧疾疫苗。研究瘧原蟲基因的功能以及瘧原蟲與宿主之間的相互作用將為研發(fā)瘧疾疫苗和發(fā)現(xiàn)新的抗瘧藥物靶標(biāo)提供可靠的信息。瘧原蟲生長發(fā)育的紅細(xì)胞期(紅內(nèi)期)階段,是引起瘧疾病人嚴(yán)重臨床病理的階段,此階段,瘧原蟲是單倍體基因組,因此使用永久性基因敲除技術(shù)無法研究必需基因的功能。在我們的研究中,我們使用小鼠伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)和夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabudi)作為瘧疾研究的模型進(jìn)行以下幾個(gè)問題的探索和研究(i)在伯氏瘧原蟲探索建立了四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)(Tetracycline-induced gene expression system,Tet-on);并采用該系統(tǒng)條件性敲除紅內(nèi)期P.berghei己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Hexose Transporter 1,HT1)基因;分析研究了該遺傳致弱性全蟲疫苗的疫苗效能。(ii)研究紅內(nèi)期P.berghei硫辛酸蛋白連接酶1(Lipoic acid protein ligase 1,LplA1)基因的功能,并探究可能的代償途徑(iii)在P.chabaudi中嘗試建立條件性基因敲除系統(tǒng),比較研究瘧原蟲與宿主細(xì)胞之間的相互作用。1.條件性敲除系統(tǒng)的建立及全蟲瘧疾疫苗的研究全蟲瘧疾疫苗被認(rèn)為是最有效的瘧疾疫苗策略,然而由于現(xiàn)有的瘧疾全蟲疫苗策略存在很多技術(shù)上的問題,從而限制了這些全蟲瘧疾疫苗進(jìn)入臨床研究。在本研究中,我們使用Tet-on系統(tǒng)條件性敲除了紅細(xì)胞期P.berghei的必需基因己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(HT conditional knockout,HT-cKO),分析了 HT-cKO瘧原蟲的表型特癥,并研究了 HT-cKO致弱性瘧原蟲感染誘導(dǎo)免疫保護(hù)力的效果。HT-cKO轉(zhuǎn)基因瘧原蟲感染小鼠后,在提供無水四環(huán)素(anhydrotetracycline,ATc)的情況下,可以正常增殖和持續(xù)提供大量的轉(zhuǎn)基因全蟲疫苗;但在不提供ATc的情況下,轉(zhuǎn)基因瘧原蟲的生長受到嚴(yán)重抑制,表現(xiàn)為自滅性感染過程,這些清除了 HT-cKO瘧原蟲初次感染的小鼠對(duì)野生型瘧原蟲攻擊感染表現(xiàn)出完全的免疫保護(hù)力。進(jìn)一步分析表明,HT-cKO瘧原蟲在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代未檢測(cè)到回復(fù)突變,表明該轉(zhuǎn)基因瘧原蟲是遺傳穩(wěn)定的,具有免疫原性的,同時(shí)也可以大規(guī)模培養(yǎng)供給疫苗使用。該研究結(jié)果表明,采用條件性敲除系統(tǒng)建立遺傳可控致弱并可誘導(dǎo)理想的免疫保護(hù)力的轉(zhuǎn)基因瘧原蟲是開發(fā)全蟲瘧疾疫苗的一條可行途徑。2.紅內(nèi)期P.berghei擁有硫辛酸拯救代償途徑硫辛酸是α-酮酸脫氫酶(α-ketoacid dehydrogenase,KADH)多酶復(fù)合物和甘氨酸切割系統(tǒng)(Glycine Cleavage System,GCV)的必需輔因子,這些脫氫酶復(fù)合物主要參與能量代謝、脂肪酸生物合成和氨基酸降解。在頂復(fù)門微生物的研究中發(fā)現(xiàn),硫辛酸蛋白連接酶1(LplA1)和硫辛酸蛋白連接酶2(LplA2)催化從環(huán)境中攝取的外源硫辛酸連接到線粒體定位的多酶復(fù)合物E2亞單位上,而辛酰載體蛋白(ACP)-N-辛酰轉(zhuǎn)移酶(octanoyl-[aycl carrier protein]:protein N-octanoyltransferase,LipB)和硫辛酸合成酶 A(Lipoic acid synthase,LipA)是定位在頂復(fù)門微生物的頂體中,催化硫辛酸的生物合成,將硫辛酸連接到丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的硫辛酸結(jié)構(gòu)域。上述硫辛酸蛋白連接酶或合成酶在硫辛酸利用中的功能有初步研究,但在頂復(fù)門微生物中的相互關(guān)系則尚未闡明。我們利用Tet-on系統(tǒng)條件性敲除了紅內(nèi)期P.berghei的LplA1基因(LplA1 conditional knockout,LplA1-cKO)并且分析研究了 LplA1-cKO瘧原蟲的表型變化和特征。結(jié)果表明,在不提供ATc時(shí),LplA1-cKO瘧原蟲在感染的前八天生長被嚴(yán)重的抑制,而八天之后轉(zhuǎn)基因瘧原蟲恢復(fù)了生長增殖能力。我們用實(shí)時(shí)定量PCR分析LplA1基因和LplA2基因的mRNA表達(dá),并發(fā)現(xiàn),在缺失LplA1的條件下,Lp1A2代償性增高表達(dá)以補(bǔ)償了 LplA1的功能。由此得出結(jié)論:紅內(nèi)期P.berghe 有選擇性硫辛酸拯救途徑,LplA2可能是LplA1的代償基因。3.夏氏瘧原蟲P.chabaudi建立條件性基因敲除系統(tǒng)伯氏瘧原蟲P.berghei在小鼠可引起致死性感染,但夏氏瘧原蟲P.chabaudi感染后,小鼠能清除瘧原蟲的感染。此外,小鼠夏氏瘧原蟲P.chabaudi與人惡性瘧原蟲P.falciparum在許多生物學(xué)特征上表現(xiàn)出相似性。我們?cè)噲D在P.chabaudi中建立條件性敲除系統(tǒng),以便將致死型P.berghe 和非致死型P.chabaudi兩種瘧原蟲做同步比較研究,以揭示不同種屬瘧原蟲特定基因功能的差異以及瘧原蟲在網(wǎng)織紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞中代謝的不同特點(diǎn)。雖然在P.chabaud 瘧原蟲中成功轉(zhuǎn)入了條件性基因敲除質(zhì)粒,并驗(yàn)證質(zhì)粒被整合到瘧原蟲基因組,但由于該瘧原蟲生存力較低,我們未能成功克隆獲得基因型一致的轉(zhuǎn)基因P.chabaudi瘧原蟲。
[Abstract]:Malaria is one of the main infectious diseases caused by Plasmodium falciparum infection . The infection area is mainly distributed in sub - Saharan Africa and Southeast Asia . The malaria parasite is the most effective way to control and treat malaria . In our study , we use Plasmodium berghei and Plasmodium chabudi to study the function of essential genes . In our study , we use the mouse Plasmodium berghei and Plasmodium chabudi to study the function of essential genes . In our study , we use the mouse Plasmodium berghei and Plasmodium chabudi to study the gene expression system of Plasmodium berghei . In this study , we studied the effect of P.berghei in P.chabaudi . P . chabaudi ( P.chabaudi ) and P.chabaudi ( P.chabaudi ) in P.chabaudi ( P.chabaudi ) and P.chabaudi ( P.chabaudi ) were used to study the expression of LPLA1 .
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R382.31

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本文編號(hào)：2067635