本文選題：先天性心臟病 + 易感性　； 參考：《南京醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：目的：文獻報道顯示干預小鼠體內COL6A2基因的表達可致子代小鼠出現(xiàn)先天性房間隔缺損的病理表型,揭示COL6A2基因的表達水平變化與房間隔缺損的發(fā)病相關,但具體的調節(jié)機制尚不清楚。非編碼RNA (microRNA, miRNA)是一類序列較短,有著高度保守性的RNA,可通過與靶基因的3'-UTR (3'-Untranslated Region)區(qū)域特異結合,調節(jié)基因的轉錄活性。而靶基因3’-UTR區(qū)域單核苷酸多態(tài)性變異(single nucleotide polymorphism, SNP)可能影響miRNA與之結合,導致靶基因表達的變化。本實驗旨在探討COL6A2基因上3'-UTR區(qū)域SNPs 是否影響 miRNA與之結合,從而在調節(jié)其在先天性房間隔缺損的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。方法：通過查詢Pubmed以及Hapmap數(shù)據(jù)庫搜索COL6A2基因3'-UTR區(qū)域中國漢族人群最小等位基因頻率大于0.05的SNP位點,結合各SNP位點之間的連鎖不平衡反應,初步篩選擬研究位點。隨后在本研究小組前期先天性心臟病間隔缺損全基因組關聯(lián)研究數(shù)據(jù)庫(Genome Wide Association Studies)中查找上述位點的數(shù)據(jù)信息,選取在先天性房間隔缺損中關聯(lián)P值小于0.1的SNPs,再使用miRNA-SNP功能預測網(wǎng)站進行功能預測,選擇預測對結合能力有影響的SNPs作為功能研究位點。將構建成功的不同miRNA的模擬物(mimic)及COL6A2基因3'-UTR序列不同SNP基因型的質粒共同轉染入HEK293T細胞系、H9C2細胞系以及SD乳鼠原代細胞系進行熒光素酶報告基因實驗。共分為四組：A.野生型質粒+無miRNA mimic; B.野生型質粒+miRNA mimic; C.突變型質粒+無miRNA mimic; D.突變型質粒+miRNA mimic。探討miRNA與COL6A2基因3’-UTR區(qū)域的結合反應,以及對COL6A2基因表達水平變化的影響。結果：通過查詢Pubmed以及Hapmap數(shù)據(jù)庫,COL6A2基因3'-UTR區(qū)域共搜索到5個中國漢族人群最小等位基因頻率大于0.05的SNP位點,分別為rs559,rs1044598, rsl 1554666, rs7717和rs73382475。通過對先天性心臟病間隔缺損GWAS數(shù)據(jù)庫的查詢,發(fā)現(xiàn)僅rs559和rs1044598位點的變異可能與先天性房間隔缺損發(fā)病風險相關。功能預測結果顯示,rs559不可調節(jié)miR-338-3p與COL6A2的結合,rs1044598可調節(jié)miR-4252與COL6A2的結合。以下為熒光素酶報告基因實驗P值：miR-4252與rs1044598質粒共轉染組,D組與B組相比,HEK 293T(P=0.013), H9C2 (P=0.012),原代心肌細胞(P=0.009) 。 miR-338-3p與rs559質粒共轉染組,A組與C組相比,HEK293T(P=0.158), H9C2 (P=0.342),原代心肌細胞(P=0.054)。結論：COL6A2基因3'-UTR區(qū)域rs1044598位點可能與先天性房間隔缺損的發(fā)病風險相關,相對于攜帶野生TT基因型的人群,AA基因型顯著減少了36%的患病風險。miR-4252可以與COL6A2的3'-UTR區(qū)序列發(fā)生有效結合,與野生型TT基因型相比,變異型AA等位基因可使miR-4252結合更穩(wěn)定,并進一步抑制COL6A2的轉錄活性,降低該基因表達水平,從而減少先天性房間隔缺損的發(fā)病風險。而miR-338-3p與COL6A2的3'-UTR區(qū)序列不能發(fā)生有效結合,從而無法調控COL6A2的表達水平。
[Abstract]:Objective: it has been reported that the expression of COL6A2 gene in mice can induce the pathological phenotype of congenital atrial septal defect in offspring, and the expression level of COL6A2 gene is related to the pathogenesis of atrial septal defect. But the specific regulation mechanism is not clear. Non-coding RNA (miRNA) is a kind of short sequence, highly conserved RNAs, which can regulate the transcriptional activity of the gene by specifically binding with the target gene's 3na-UTR (3- untranslated region) region. The single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the target gene 3nc-UTR region may affect the binding of miRNAs and lead to the change of target gene expression. The aim of this study was to investigate whether SNPs in the 3H-UTR region of COL6A2 gene affect miRNA binding and thus play an important role in regulating the occurrence of congenital atrial septal defect. Methods: by querying Pubmed and Hapmap database, we searched for SNP loci in Chinese Han population with minimum alleles frequency greater than 0.05 in COL6A2 gene 3na-UTR region. Combined with linkage disequilibrium reaction among SNP loci, we preliminarily selected the sites to be studied. We then searched the Genome wide Association Studies database for these sites in our team's Genome wide Association Studies database for the early stage of congenital heart disease septal defect. SNPs with P value less than 0.1 in congenital atrial septal defect were selected, and then miRNA-SNP function prediction site was used to predict the function of SNPs. SNPs, which had influence on binding ability, were selected as functional research sites. The plasmids with different SNPs of (mimic) and COL6A2 gene were co-transfected into H9C2 cell line of HEK293T cell line and primary cell line of SD rat for luciferase reporter gene experiment. It was divided into four groups: A. Wild type plasmid without miRNA mimic. B. Wild type plasmid miRNA mimic; C. The mutant plasmid has no miRNA mimic.D. Mutant plasmid miRNA mimic. To study the binding reaction of miRNA with COL6A2 gene 3- UTR region and the effect of miRNA on the expression level of COL6A2 gene. Results: five SNPs with minimum alleles frequency greater than 0. 05 were found in Pubmed and Hapmap database. The minimum alleles were rs559, rs1044598, rsl 1554666, rs7717 and rs73382475, respectively. Only rs559 and rs1044598 loci were found to be associated with the risk of congenital atrial septal defect (CHD) by querying the Gwas database of congenital heart disease septal defect (CHD). The results of functional prediction showed that the combination of rs559 unadjustable miR-338-3p and COL6A2 could be adjusted by the combination of miR-4252 and COL6A2. The following is the experiment of luciferase reporter gene P value: miR-4252 and rs1044598 plasmid cotransfection group compared with group B: HEK293T (P0. 013), H9C2 (P0. 012), primary cardiomyocytes (P0. 009). MiR-338-3p co-transfected with rs559 plasmid group A compared with group C, HEK293T (P0. 158), H9C2 (P0. 342), primary cardiomyocytes (P0. 054). Conclusion the rs1044598 locus of the 3-UTR region of the 1: COL6A2 gene may be associated with the risk of congenital atrial septal defect. Compared with the population carrying the wild TT genotype, the AA genotype can significantly reduce the risk of the disease by 36%. MiR-4252 can be effectively combined with the 3- UTR region sequence of COL6A2. Compared with the wild-type TT genotype, the mutant AA allele could make miR-4252 binding more stable, further inhibit the transcription activity of COL6A2 and decrease the expression level of the gene, thus reducing the risk of congenital atrial septal defect. However, miR-338-3p could not combine with COL6A2 3-UTR region effectively, which could not regulate the expression level of COL6A2.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R541.1

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本文編號：2058904