發(fā)布時(shí)間：2018-06-22 19:47

  本文選題：白氏文昌魚 + TAB1基因　； 參考：《南京師范大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,可調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程。TGF-β激活激酶-1(TAK1),也稱為絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7),最初是作為MAPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶被發(fā)現(xiàn)的。TAK1通過(guò)介導(dǎo)激活核因子κB (NF-κB)、c-Jun氮末端激酶(JNK)和p38通路來(lái)應(yīng)對(duì)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α和toll樣受體的刺激。TAB1(也就是TAK1結(jié)合蛋白)是蛋白激酶TAK1的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基,并且可以特異性的作用于TAK1氮末端從而直接誘導(dǎo)TAK1激酶活性。文昌魚在進(jìn)化過(guò)程中作為無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間的過(guò)渡物種,位于脊索動(dòng)物的底端,是研究脊椎動(dòng)物免疫進(jìn)化的重要材料。為了進(jìn)一步的研究TAB1基因的功能和進(jìn)化,本論文首次克隆了白氏文昌魚的TAB1基因,對(duì)該基因序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析,并且采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出了白氏文昌魚TAB1蛋白。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TAB1基因的時(shí)空表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：(1)采用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆得到白氏文昌魚TAB1基因全長(zhǎng)序列。TABl基因全長(zhǎng)為2281bp,其中ORF序列長(zhǎng)度為1659bp,可編碼533個(gè)氨基酸,5’非翻譯區(qū)長(zhǎng)度為89bp,3’非翻譯區(qū)長(zhǎng)度為533bp。利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了PET32a-TAB1表達(dá)載體,通過(guò)原核表達(dá)實(shí)驗(yàn),IPTG低溫誘導(dǎo)6h后成功表達(dá)出大小為62KDa的特異性蛋白,進(jìn)一步利用Anti-His tag抗體采用Western blot方法初步驗(yàn)證該特異蛋白就是重組表達(dá)的TAB1蛋白。(2)白氏文昌魚TAB1基因相關(guān)生物信息學(xué)分析表明：文昌魚TAB1蛋白序列與其它物種之間相似性高；文昌魚TAB1基因組由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成；文昌魚TAB1基因序列含有一個(gè)特異的PP2Cc結(jié)構(gòu)域；與另外20個(gè)物種的TAB1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果表明白氏文昌魚TAB1位于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間且白氏文昌魚TAB1基因?qū)儆赥AB1基因家族。(3)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)文昌魚TAB1基因在鰓、肝盲囊、腸、肌肉、脊索和性腺等6個(gè)不同組織中的表達(dá)量情況,結(jié)果表明文昌魚TAB1基因在各個(gè)組織中都有表達(dá),且TAB1基因在性腺中的表達(dá)量最高,在肝盲囊、肌肉和脊索中的表達(dá)量相對(duì)較高,在鰓和腸中的表達(dá)量最低。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TAB1基因在LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(2h,4h,6h,8h,10h,12h,24h和48h)的表達(dá)量情況。結(jié)果表明文昌魚TAB1基因在6h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)差異(P0.05)。本論文首次在白氏文昌魚中克隆研究TAB1基因,為文昌魚的先天免疫研究提供新的信息,并為TAB1基因家族的進(jìn)化研究提供有意義的信息。
[Abstract]:Mitogen-activated protein kinase (MAPKs) is a serine / threonine kinase family. TGF- 尾 activated kinase 1 (TAK1), also known as mitogen-activated protein kinase 7 (MAP3K7), was first found as a serine / threonine kinase in the MAPK family by mediating the activation of nuclear factor- 魏 B (NF- 魏 B) c-Jun nitrogen terminal. Terminal kinase (JNK) and p38 pathway respond to the stimulation of interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor- 偽 (TNF- 偽) and toll like receptor. TAB1 (TAK1-binding protein) is a regulatory subunit of protein kinase TAK1. Furthermore, TAK1 kinase activity can be induced directly by acting specifically on the end of TAK1 nitrogen. Amphioxus, as a transitional species between invertebrates and vertebrates, is located at the bottom of vertebrates and is an important material for studying the immune evolution of vertebrates. In order to further study the function and evolution of TAB1 gene, the TAB1 gene of amphioxus was cloned for the first time, and the sequence of TAB1 gene was analyzed by bioinformatics. The TAB1 protein of amphioxus was successfully expressed by prokaryotic expression system. The temporal and spatial expression patterns of TAB1 gene were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results were as follows: (1) the total length of TAB1 gene was 2281bp.TABl gene was cloned by RT-PCR and RACE-PCR. The length of ORF sequence was 1659bpand the length of 533 amino acid 5'untranslated region was 89bpn3'untranslated region 533bp. The expression vector PET32a-TAB1 was constructed by DNA recombination technique. The specific protein of 62 KDa was successfully expressed after 6h induction by IPTG. The specific protein was confirmed to be a recombinant TAB1 protein by using anti-His tag antibody. (2) the bioinformatics analysis of TAB1 gene in amphioxus showed that the sequence of TAB1 protein in amphioxus was similar to that of other species. The TAB1 genome of amphioxus consists of 8 exons and 7 introns; the TAB1 gene sequence of amphioxus contains a specific PP2Cc domain; and the phylogenetic tree is constructed with TAB1 amino acid sequences of 20 other species. The results showed that TAB1 was located between invertebrate and vertebrate, and TAB1 gene belonged to TAB1 gene family. (3) the TAB1 gene in Gill, liver blind sac, intestine and muscle of amphioxus was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that TAB1 gene of amphioxus was expressed in all tissues, and TAB1 gene was the highest in gonad, and higher in hepatic blind sac, muscle and chordal cord. The lowest expression was found in the Gill and intestine. The expression of TAB1 gene at different time points after LPS stimulation was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the relative expression of TAB1 gene in amphioxus was different at 6 h (P0.05). In this paper, the TAB1 gene was cloned and studied in amphioxus for the first time, which provided new information for the study of innate immunity of amphioxus and meaningful information for the evolution of TAB1 gene family.
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q953

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本文編號(hào)：2054033