本文選題：腺苷 + 菌種退化��； 參考：《河南師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷,對心血管系統(tǒng)和肌體的許多其它系統(tǒng)及組織均有生理作用,是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷以及許多抗病毒性藥物的重要中間體。目前在工業(yè)上主要以糖質(zhì)為原料發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。但國內(nèi)腺苷的生產(chǎn)效率仍有較大的提高空間,可通過誘變育種以及基因工程的方法來改造菌種,優(yōu)化發(fā)酵條件來改善和提高產(chǎn)量、降低成本;同時在生產(chǎn)過程中還存在生產(chǎn)菌株遺傳性狀和產(chǎn)量不穩(wěn)等問題。本實驗室保藏的一株能夠積累腺苷的菌株Bacillus subtilis DI4-24,經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng),菌種退化現(xiàn)象嚴(yán)重,其遺傳性狀組氨酸缺陷極易發(fā)生丟失,不利于腺苷的工業(yè)化生產(chǎn)。本研究以分離純化后的退化菌株B.subtilis DI4-24R為出發(fā)菌株,利用常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)進(jìn)行誘變處理,重新獲得了增加組氨酸缺陷型菌株,進(jìn)行遺傳性狀穩(wěn)定性和高產(chǎn)腺苷的選育,并首次嘗試通過基因敲除技術(shù)定向改造菌株,來使生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性能增強的研究。主要研究內(nèi)容如下:1.菌種退化的原因分析。通過對高產(chǎn)腺苷菌株B.subtilis DI4-24分離純化和遺傳表型分析,得到菌落形態(tài)和遺傳標(biāo)記都發(fā)生改變的退化菌株B.subtilis DI4-24R,其產(chǎn)苷性能退化的原因為組氨酸缺陷型高頻率地發(fā)生回復(fù)突變所致,退化菌菌株產(chǎn)量大幅度降低至4.34 g/L。2.以B.subtilis DI4-24R為出發(fā)菌株,進(jìn)行ARTP誘變處理,經(jīng)過初篩選到his-恢復(fù)的突變株。實驗表明,ARTP誘變放電照射10 s誘變效果最佳,正變率高。經(jīng)過復(fù)篩得到了一株高穩(wěn)產(chǎn)腺苷菌株B.subtilis AR-27,傳代6次該菌株依然保持相當(dāng)高的產(chǎn)腺苷能力,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)苷量達(dá)到15.84 g/L,比出發(fā)菌株產(chǎn)量提升了近3倍,his-回變率大幅下降至9.3×10-8,其產(chǎn)苷性能和遺傳穩(wěn)定性得到顯著提高。3.對突變菌株B.subtilis AR-27進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗,通過生長因子、葡萄糖、以及氮源物質(zhì)的單因子實驗和多因素正交試驗,確定了最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖11 g/L、豆粕80 mL/L、玉米漿60 mL/L、酵母精粉12 g/L、氯化銨15 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、硫酸亞鐵0.02 g/L、硫酸錳0.02 g/L、氯化鈣5 g/L、碳酸鈣20 g/L、亮氨酸0.02 g/L、谷氨酸0.02 g/L、組氨酸50 mg/L。在優(yōu)化的培養(yǎng)基中產(chǎn)苷水平達(dá)16.12 g/L,產(chǎn)苷能力提高了10%。4.在NCBI上檢索出枯草芽孢桿菌his C基因序列,以此為根據(jù)分別設(shè)計上下游引物,PCR擴增DI4-24R細(xì)胞基因組,得到上游(TF)與下游(TB)的同源序列,將上下游同源序列融合連接,片段大小為1000 bp左右,將目的片段與T載體連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒T-H。5.提取穿梭質(zhì)粒載體pMAD和重組質(zhì)粒,分別用限制性內(nèi)切酶BamH、BglⅡ酶切后,采用新技術(shù)in-fusion處理后,轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)胞,篩選得到hisC基因缺失的同源重組質(zhì)粒pMAD-H。將同源重組質(zhì)粒pMAD-H電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入受體細(xì)胞DI4-24R中,用抗性平板篩選克隆子,得到B.subtilis DI4-24R(pMAD-H)轉(zhuǎn)化菌株,為后續(xù)的同源重組工程菌的篩選奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:A mutant strain B . subtilis DI4 - 24R , which can accumulate adenosine , can be transformed into strain B . subtilis DI4 - 24R . The homologous sequences of upstream ( TF ) and downstream ( TB ) were amplified by restriction endonuclease BamHI and Bgl II . The recombinant plasmid pMAD - H was transformed into the recipient cells DI4 - 24R .
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q93

【參考文獻(xiàn)】

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7 劉s，

本文編號：2050152