本文選題：豬 + 層粘連蛋白�。� 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：層粘連蛋白(Laminin,LN)是細(xì)胞膜的重要成分,采用LN作為細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)多能干細(xì)胞,可以維持干細(xì)胞的自我更新和多能性。LN家族中有15種不同的亞型,每一種亞型由三條肽鏈(α、β、γ)組成,形成十字架結(jié)構(gòu)的異源三聚體。其中Laminin A5(LAMA5)對于維持多能干細(xì)胞的生長有重要作用。本研究旨在檢測豬不同組織和細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)情況,研究LN在多能干細(xì)胞分化過程中的時空表達(dá)特性;通過生物信息學(xué)分析和分子克隆,確認(rèn)豬LAMA5基因的存在和表達(dá)變化;發(fā)現(xiàn)并分子克隆了與豬多能干細(xì)胞特性相關(guān)的Laminin B1-a(LAMB1-a)可變剪接體。本研究豐富了對豬多能干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)研究的信息,為研究豬干細(xì)胞多能性的維持提供了理論依據(jù)。本研究獲得的主要結(jié)果如下:1.LAMININ在豬組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜分析用RT-PCR檢測豬不同組織(肝臟、心臟、肺、胃、腦、睪丸、脂肪、顆粒細(xì)胞組織)、體細(xì)胞(肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、豬胎兒成纖維細(xì)胞)和多能干細(xì)胞(DOX-iPS、PS11、PS23)中LAMININ不同亞型的表達(dá)情況。結(jié)果表明,不同組織和細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)存在明顯差異。通過比對組織來源和細(xì)胞來源的樣品發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特異性更加突出,其中在PEF細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特征為:LAMA4/5-LAMB1/2-LAMC1/2(即LN-411、LN-421、LN-511和LN-521);在豬iPS細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特征為:LAMA1/5-LAMB1-a/2-LAMC1(即LN-11a1、LN-121、LN-51a1和LN-521)。2.豬LAMA5的生物學(xué)分析和克隆未注釋有豬LAMA5基因的序列信息和相關(guān)報道。為此我們運用NCBI和UCSC等數(shù)據(jù)庫,分析人、牛和山羊的LAMA5基因序列,預(yù)測豬LAMA5基因,以RPS21和CABLES2基因?qū)ωi基因組數(shù)據(jù)庫(Sscrofa11.1)中LAMA5的可能序列區(qū)域進(jìn)行定位。通過DNAMAN(V6)軟件進(jìn)行比對,確認(rèn)了豬LAMA5的序列,并設(shè)計特異性引物,從豬肺組織樣c DNA中克隆了長度為731 bp的豬LAMA5基因序列。測序結(jié)果與人和牛LAMA5序列高度一致,序列上傳至GENBANK,獲得登錄號:KY622023。3.豬多能干細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特性和LAMB1-a可變剪接體的發(fā)現(xiàn)通過檢測,發(fā)現(xiàn)豬iPS細(xì)胞中,LAMB1出現(xiàn)了兩條特異性條帶,為了進(jìn)一步研究LAMB1的性質(zhì),對克隆的兩條特異性條帶(LAMB1 505bp、LAMB1-a 639bp)進(jìn)行測序,結(jié)果顯示與NCBI中已有的LAMB1-X1和LAMB1-X2序列不一樣,發(fā)現(xiàn)LAMB1-a是一個新的可變剪接體。為了進(jìn)一步探討LAMB1與多能干細(xì)胞的相關(guān)性,選取豬PEF和豬多能干細(xì)胞DOX-iPS及分化的iPS細(xì)胞進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,隨著多能干細(xì)胞形態(tài)的改變,細(xì)胞團(tuán)形態(tài)逐漸消失,LAMB1-a的表達(dá)逐漸下降,當(dāng)再次運用DOX-iPS培養(yǎng)基培養(yǎng)后,當(dāng)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)再次恢復(fù)的時候,LAMB1-a的表達(dá)逐漸恢復(fù)。在檢測中還發(fā)現(xiàn),在iPS重編程過程中LAMA4的表達(dá)隨著細(xì)胞的分化程度,其表達(dá)量明顯升高,相反在細(xì)胞分化的過程中LAMA1的表達(dá)量逐漸降低�？傊�,本研究確定了豬多能干細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特征,即LN11a1/LN121和LN51a1/LN521;確認(rèn)了豬LAMA5基因的存在,并分析和克隆了該基因;發(fā)現(xiàn)了LAMB1-a可變剪接體,并驗證了該基因與多能干細(xì)胞的對應(yīng)關(guān)系。
[Abstract]:Laminin (LN) is an important component of the cell membrane. Using LN as a cell matrix to cultivate pluripotent stem cells, there are 15 different subtypes in the self-renewal of stem cells and the pluripotent.LN family. Each subtype consists of three peptide chains (alpha, beta, and gamma), forming a hetero trimer of the cross structure. Among them, Laminin A5 (LAMA5) The purpose of this study is to maintain the growth of pluripotent stem cells. The purpose of this study is to detect the expression of LAMININ in different tissues and cells of pigs and to study the temporal and spatial expression of LN in the differentiation of pluripotent stem cells. Through bioinformatics analysis and molecular cloning, the existence and expression changes of porcine LAMA5 genes are confirmed; and the molecular cloning of molecular cloning is found. Laminin B1-a (LAMB1-a) variable splicing body related to the characteristics of porcine pluripotent stem cells. This study enriches the information on the study of porcine pluripotent stem cell culture matrix and provides a theoretical basis for the study of the maintenance of the pluripotent activity of pig stem cells. The main results obtained in this study are as follows: the analysis of the expression profiles of 1.LAMININ in pig tissues and cells is RT-PCR The expression of different subtypes of LAMININ in different tissues (liver, heart, lung, stomach, stomach, brain, testicle, fat, granulosa cell tissue), somatic cells (hepatocytes, adipocytes, DOX-iPS, PS11, PS23), and the expression of LAMININ in different tissues and cells showed that the expression of LAMININ in different tissues and cells was significantly different. Samples of tissue source and cell source have found that the expression of LAMININ is more prominent in the cell, and the expression of LAMININ in PEF cells is LAMA4/5-LAMB1/2-LAMC1/2 (LN-411, LN-421, LN-511 and LN-521), and LAMININ expression in the pig iPS cells is LAMA1/5-LAMB1-a/2-LAMC1. 1) the biological analysis and cloning of.2. pig LAMA5 have not been annotated with the sequence information and related reports of the pig LAMA5 gene. Therefore, we use the database of NCBI and UCSC to analyze the LAMA5 gene sequence of human, cattle and goat, predict the pig LAMA5 gene, and take RPS21 and CABLES2 gene to the possible sequence region of the LAMA5 of the pig genome database (Sscrofa11.1). Location. The sequence of pig LAMA5 was confirmed by DNAMAN (V6) software and specific primers were designed. The gene sequence of pig LAMA5 gene was cloned from pig lung tissue like C DNA. The sequence of LAMA5 gene was 731 BP, and the sequence was highly consistent with the sequence of human and bovine LAMA5, and the sequence was uploaded to GENBANK, and LAMININ in KY622023.3. porcine pluripotent stem cells. The discovery of expression characteristics and the discovery of LAMB1-a variable splice body found two specific bands of LAMB1 in pig iPS cells. In order to further study the properties of LAMB1, the two specific bands of the clone (LAMB1 505bp, LAMB1-a 639bp) were sequenced. The results showed that L was different from LAMB1-X1 and LAMB1-X2 sequences in NCBI, and L was found to be L. AMB1-a is a new variable splice body. In order to further explore the correlation between LAMB1 and pluripotent stem cells, the porcine PEF and porcine pluripotent stem cells DOX-iPS and the differentiated iPS cells were detected. The results showed that the morphology of the cells gradually disappeared and the expression of LAMB1-a decreased gradually with the morphologic changes of the pluripotent stem cells. When DOX-iP was used again, the expression of DOX-iP was gradually reduced. After the culture of S medium, the expression of LAMB1-a was gradually restored when the cell morphology was restored again. In the test, the expression of LAMA4 was obviously increased with the degree of cell differentiation in the iPS reprogramming process. On the contrary, the expression of LAMA1 was gradually reduced during the process of cell differentiation. The expression of LAMININ in stem cells, namely, LN11a1/LN121 and LN51a1/LN521, confirmed the existence of the porcine LAMA5 gene, and analyzed and cloned the gene, and found the LAMB1-a variable splice body, and verified the relationship between the gene and the pluripotent stem cells.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q813

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本文編號：2039592