本文選題：造血干細胞移植 + 中樞免疫　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的異基因造血干細胞移植(allo-HSCT, allogeneic hematipoietic stem cell transplantation)是治療多種血液系統(tǒng)腫瘤、骨髓衰竭、遺傳性疾病和某些實體瘤的有效手段。自從20年代50世紀,第一例造血干細胞移植開始,前前世界上移植病例數(shù)已超過一百萬。隨著對人類白細胞抗原(HLA, human leukocyte antigen)的認識和配型技術(shù)的發(fā)展,對移植物抗宿主病(GVHD, graft-versus-host disease)和移植物抗白血病(GVL, graft-versus-leukemia)效應的認識,以及對移植相關(guān)毒副作用和并發(fā)癥防治的研究,移植技術(shù)有了顯著的進步,使白血病患者的長期生存達到40%-60%。但是異基因造血干細胞移植后免疫重建延遲(特別是中樞免疫重建延遲)引起的免疫缺陷導致移植后機會感染和移植后白血病復發(fā),嚴重影響了造血干細胞移植的長期療效。兇此如何加快移植后免疫重建,縮短移植后免疫缺陷時間以及減少移植后復發(fā)是甬需解決的問題。異基岡造血干細胞移植后免疫重建可分固有免疫重建和適應性免疫重建兩個方面。固有免疫重建包括自然殺傷細胞(NK, natural killer cell)功能的恢復以及樹突狀細胞(DC)等對抗原處理及提旱的功能恢復；適應性免疫重建包括T細胞、B細胞的數(shù)量和功能的恢復。NK細胞在異基因造血干細胞移植后出現(xiàn)最早,移植后的1-2個月可恢復至移植前水平,CD56brightCD16dim細胞是NK恢復早期的主要亞群。B淋巴細胞的重建時間僅次于NK細胞,數(shù)量恢復一般需2-8個月,分泌免疫球蛋白(lg, immunoglobulin)的功能恢復需要1-2年。T淋巴細胞恢復緩慢,CD8+T細胞數(shù)量及功能恢復,一般需2-8個月；CD4+T細胞的重建最慢,一般需要1-2年時間才能完全恢復,甚至需要更長的時間。胸腺是哺乳動物的中樞免疫器官,主要負責產(chǎn)生和輸出初始T淋巴細胞,在移植后T細胞免疫重建具有重要作用。骨髓造血干細胞分化成淋巴前體細胞,通過血液遷移至胸腺后成為胸腺細胞；隨后在遷移至被膜下皮質(zhì)區(qū)的過程中分化成為三陰性淋巴細胞(TNC, triple-negative cell)。TNC在胸腺皮質(zhì)區(qū)域中發(fā)生T細胞抗原受體(TCR, T cell receptor)重排,變成了具有CD4和CD8表面受體的雙陽性細胞(DP, double-positive)。此后DP細胞遷移至皮髓質(zhì)交界區(qū),經(jīng)過陽性和陰性選擇,轉(zhuǎn)變?yōu)閮煞N單陽性T細胞(SP, single-positive),并使得T細胞獲得了識別非己抗原的能力。經(jīng)過這個發(fā)育過程,最后只有約5%的細胞發(fā)育成熟為新生初始T淋巴細胞并輸出至外劇的淋巴器官中,但是這些新生初始T淋巴細胞卻在機體細胞免疫的活動中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由胸腺上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、胸腺基質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)構(gòu)成特定三維結(jié)構(gòu)的胸腺微環(huán)境對T細胞的發(fā)育起關(guān)鍵作用。其中胸腺上皮細胞是胸腺微環(huán)境特定三維結(jié)構(gòu)的豐要細胞,包括皮質(zhì)胸腺上皮細胞(cTECs, cortical thymic epithelial cells)和髓質(zhì)胸腺上皮細胞(mTECs, medullary thymic epithelial cells),它們與胸腺T細胞直接接觸并提供必要的刺激信號,從而促進胸腺T細胞的發(fā)育。由此可見,胸腺(尤其是胸腺上皮細胞)功能在T細胞免疫重建中發(fā)揮及其重要的作用。胸腺對免疫損傷十分敏感,大劑量放療、化療、免疫抑制劑的使用和GVHD均使胸腺損傷,導致胸腺萎縮,影響初始T細胞的產(chǎn)生。經(jīng)X射線傘身照射后的小鼠,胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)上皮細胞數(shù)量明顯減少,導致胸腺T細胞發(fā)育所需的細胞因子和趨化因子的分泌明顯減少,從而影響胸腺T細胞的發(fā)育。清髓性的預處理方案可能是通過改變胸腺基質(zhì)細胞功能,使移植后胸腺輸出淋巴細胞的數(shù)量與質(zhì)量明顯下降。GVHD可引起胸腺細胞的減少以及基質(zhì)細胞成分的改變,從而影響胸腺T淋巴細胞的發(fā)育、分化及輸出功能。移植后預防及治療GVHD使用的大量免疫抑制藥物,也可損傷胸腺,導致T細胞功能缺陷。隨著年齡的增長,骨髓中的造血干細胞的多能性及分化能力降低,淋巴祖細胞減少,加.上胸腺的增齡性退化,尤其是髓質(zhì)部分的萎縮,使得老年患者的適應性免疫應答減弱,加上各項免疫功能的退化以及移植前放化療等免疫損傷,造成其胸腺輸出T細胞功能較年輕患者明顯下降,免疫重建明顯延遲。目前異基因造血干細胞移植后改善和提高胸腺功能的治療策略主要有細胞因子、激素及細胞治療三個方面。角化生長因子(KGF, keratinocyte growth factor)通過與胸腺上皮細胞上的KGF受體相互作用,提供了生長所需的trophic信號,從而改善對T細胞生長非常重要的胸腺的微環(huán)境而起到促進免疫重建的作用。IL-7是一種促進淋巴細胞增殖的細胞因子,通過促進早期胸腺祖細胞的增殖,改善免疫重建的速度和程度。生長激素(GH, growth hormone)在移植小鼠的模型中可增加胸腺細胞密度、增加胸腺上皮細胞數(shù)量、保護骨髓免受放射損傷、延遲胸腺萎縮和增加T細胞輸出而起到改善免疫重建的作用。胰島素樣牛長因子-1(IGF-1, insulin-like growth factor)和牛長激素促分泌物(GHSs, growth hormone secretagogues)可能是通過促進生長激素釋放從而促進胸腺上皮細胞增殖而改善免疫功能重建。向移植后患者輸注前體T細胞可增加胸腺密度,促進胸腺基質(zhì)再生,提高T細胞嵌合度并改善外周T細胞和NK細胞重建。腦腸肽(Ghrelin)是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一生長激素釋放激素受體(GHS-R, growth hormone secretagogue receptor)的內(nèi)源性配體,有很強的劑量依賴性促生長激素釋放作用,通過GH-IGF1分泌軸影響胸腺功能；Ghrelin可與T細胞、B細胞、單核細胞等免疫細胞上的GHS-R結(jié)合,起到控制和調(diào)節(jié)細胞兇子分泌、免疫細胞活化、運輸和凋亡等作用。在老年小鼠模型中,注射Ghrelin可增加胸腺上皮細胞數(shù)量,減少脂肪細胞；增加早期胸腺祖細胞、多能干細胞的數(shù)目；增強胸腺近期輸出功能,提高TCR的多樣性和CD4+、CD8+T細胞生成。Ghrelin在免疫調(diào)節(jié)及胸腺功能方面具有秋極作用,在免疫重建方面有非常好的應用前景。異基因造血干細胞移植后感染、復發(fā)和GVHD,是威脅患者長期生存的主要因素,這些均與免疫重建的延遲密切相關(guān),尤其是T細胞免疫重建延遲,然而胸腺功能是T細胞免疫重建的關(guān)鍵環(huán)節(jié),國內(nèi)外學者針對如何加快移植后胸腺功能免疫重建提出了不同的策略。其中Ghrelin在免疫調(diào)節(jié)及胸腺功能方面具有積極作用,能夠促進老年小鼠胸腺功能的重建。Ghrelin可以增加老年小鼠胸腺細胞數(shù)量,顯著改善胸腺結(jié)構(gòu)使胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界更清楚,顯著減少胸腺脂肪細胞,增加胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)上皮細胞數(shù)量,增加胸腺早期祖細胞、多能干細胞、增加胸腺輸出功能、改善CD4+T、CD8+T細胞的TCR多樣性,通過改善上述各個方而使老化胸腺恢復青春,重建免疫功能。雖然Ghrelin對胸腺功能的研究主要集中在老年小鼠上,對異基因造血干細胞移植后免疫重建研究不不多,但是這種對胸腺以及T細胞的重建作用能否同樣出現(xiàn)在異基因造血干細胞移植后的免疫重建上?是否通過GH發(fā)揮作用?與GH促進移植后免疫重建有何不同?這些問題都尚未得到解答。因此本實驗通過建立同種異基因小鼠的骨髓移植模型,在移植前后不同時間注射Ghrelin,測定移植后不同時間點胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、T細胞各亞群(CD4+/CD8+)數(shù)量和T細胞受體刪除環(huán)(TREC, T-cell receptor excision circle)表達量,初步探究Ghrelin對異基因骨髓移植后小鼠T細胞免疫重建特別是中樞免疫重建的影響。研究方法1.建立同種異基因清髓性骨髓移植模型供鼠為C57BL/6小鼠(H-2Kb),受鼠為BALB/c小鼠(H-2Kd)。首先摸索出最小的清髓性輻射劑量,之后以此輻射劑量作為骨髓移植前的預處理；然后摸索出輸注骨髓細胞的最佳數(shù)量,以此作為骨髓移植細胞量,檢測骨髓嵌合率及觀察有無GVHD發(fā)生,建立同種異皋因清髓性骨髓移植模型。2.在異基因骨髓移植模型的基礎上進行實驗,實驗分為三組,移植前腦腸肽組(GG組)：骨髓移植前7天(-7d)起每日腹腔注射0.2ml (20μg) Ghrelin至移植后第28天；移植后腦腸肽組(PG組)：骨髓移植前7天至移植當天每日腹腔注射0.2ml PBS,骨髓移植第1天(1d)起每日腹腔注射0.2ml (20μg) Ghrelin全第28天；PBS對照組(PP組)：骨髓移植骨髓移植前7天起每日腹腔注射0.2ml PBS至第28天。3.骨髓移植后觀察小鼠的一般狀況,每周測體重兩次,觀察GVHD的臨床表現(xiàn)及病理改變；骨髓移植后14天、21滅及28天分別測定3組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)；取胸腺制備組織切片,顯微鏡下觀察其改變；用流式細胞術(shù)檢測供受者骨髓嵌合率及脾臟T淋巴細胞亞群；提取胸腺及脾臟細胞DNA,用SYBR Green Ⅰ法實時定量PCR (RT-PCR, real time-polymerase chain reaction)檢測胸腺及脾臟細胞中TREC表達量。結(jié)果1.接受7.0Gy全身照射(TBI, total-body irradiation)的小鼠能夠長期存活,而接受其他三組劑量TBI的小鼠均死丁造血衰竭,表明7.5Gy為最小致死劑量,作為本實驗的清髓性預處理方案。分別輸注5×106及2×107個骨髓細胞進行移植,發(fā)現(xiàn)兩組生存率無差異(P0.05),但輸注2×107個骨髓細胞的小鼠嵌合率更高。2.骨髓移植后GG、PG、PP組體重均有下降,移植后第7天開始均有增加,體重增減幅度一致。至第28天時,GG、PG、PP組分別增加0.68g、0.19g、0g,雖然移植前后均注射Ghrelin的GG組增重較其他兩組稍高,但三組間增重無統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.各組小鼠移植后28天骨髓細胞供體細胞嵌合率均達到90%以上,均無明顯皮膚受損、弓背及腹瀉等GVHD表現(xiàn),皮膚、肝臟及小腸組織切片未見明顯淋巴細胞浸潤。4.骨髓移植后的小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均低于正常水平,通過比較不同組別的可以發(fā)現(xiàn),在移植后同一時間段,三組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)無統(tǒng)計學差異(P0.05)；在同一組中,移植后14天、21天與28天胸腺和脾臟指數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.移植后胸腺均有損傷,主要表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)受到不同程度破壞,皮質(zhì)與髓質(zhì)界限不清,胸腺細胞明顯減少；GG組移植后14天,小鼠胸腺結(jié)構(gòu)基本恢復,皮髓質(zhì)分界清楚,但胸腺細胞較少；移植后21天皮質(zhì)明顯增厚,髓質(zhì)較14天增厚,胸腺細胞密度增加；移植后28天,髓質(zhì)明顯增厚,且胸腺細胞密度明顯增加。PG組在給藥14天后,胸腺結(jié)構(gòu)術(shù)見恢復,且胸腺細胞較少；給藥21天后胸腺細胞有所增加,但皮髓質(zhì)分界仍不清楚；28天后可見到皮質(zhì)明顯增厚,皮髓質(zhì)分界較前清晰。僅給予PBS處理的PP組,雖然隨著時間的增加,胸腺細胞有所增加,但至28天時,胸腺組織結(jié)構(gòu)仍未恢復,皮髓質(zhì)界限不清。6.移植后14天各組小鼠T細胞亞群絕對數(shù)水平都較低；GG組移植后21天CD4+T細胞明顯高于PG與PP組(P0.05),移植后28天這種差異更明顯(P0.05),CD4+T細胞數(shù)已達到22.03±5.40x105個,CD4+T/CD8+T比值已經(jīng)為2.16±0.27,幾乎接近正常水平。移植后28天PG組的CD4+T細胞數(shù)較PP組高(P0.05),達到13.97±3.58×105個,CD4+T/CD8+T比值為1.84±0.54,但PP組的CD4+T/CD8+T比值在移植后第28天仍是倒置的。各組T細胞絕對數(shù)的變化主要體現(xiàn)在CD4+T方面,CD8+T在不同時間及刁不同組之間均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。7.在移植后第14天,各組小鼠均無法測出脾臟TREC,胸腺TREC表達量也較低；到移植后第21天脾臟和胸腺TREC表達量有所升高,GG、PG、PP組胸腺TREC分別為0.0155±0.0101、0.0133±0.0101、0.0105±0.0056；第28天脾臟TREC繼續(xù)升高,胸腺TREC反而有所下降,但是上述變化在統(tǒng)計學上并無差異(P0.05),且三個不同處理組問在同一時問點的脾臟和胸腺TREC表達量亦無統(tǒng)計學差異(P0.05)。然而從表達水平上看,胸腺中的TREC表達量明顯高于脾臟中的(P0.05)。結(jié)論1. BALB/c小鼠接受X射線TBI的最小致死劑量是7.5Gy,輸注骨髓細胞輸注5×106、2×107個骨髓細胞生存率無差異,后者小鼠嵌合率更高,基于后者建市的骨髓移植模型,無GVHD的發(fā)生,是研究移植后免疫重建的良好模型。2.異基因骨髓移植后注射Ghrelin對小鼠體重無影響,對移植后28天內(nèi)的胸腺和脾臟TREC表達量無影響,不能改善胸腺近期輸出初始T細胞的功能。而移植后胸腺功能的恢復是移植后免疫重建的重要環(huán)節(jié),需要進一步研究Ghrelin在移植28天后對胸腺功能的影響。3.異基因骨髓移植后連續(xù)注射Ghrelin可以促進胸腺結(jié)構(gòu)恢復,增加胸腺細胞密度及脾臟CD4+T數(shù)量；但移植前7天就開始連續(xù)注射Ghrelin的小鼠胸腺結(jié)構(gòu)恢復較快,胸腺細胞密度更高,脾臟CD4+T數(shù)量也更多,說明Ghrelin可促進小鼠異基因骨髓移植后免疫重建,且移植前注射Ghrelin對TBI造成的胸腺損傷有一定的保護作用。Ghrelin免疫重建的促進作用有望應用于臨床,并可能成為未來克服移植后免疫重建延遲的重要途徑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7

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