本文選題：Streptomyces + lavendulae　； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：Streptomyces lavendulae gCLA4是從黃瓜葉片分離到的一株內(nèi)生放線菌,室內(nèi)及田間試驗均表明其能抑制多種病原菌的生長,有良好的生物防治功能。為揭示gCLA4生防機(jī)理,探究其生物活性物質(zhì),也為生物農(nóng)藥的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。本研究對gCLA4的基因功能進(jìn)行預(yù)測,選取gCLA4外泌蛋白中所有氨基酸數(shù)大于100小于1000的94個未知功能蛋白和可能有生防活性的8個功能蛋白chitosanase(278)、chitinase(3253、4025、4203、5554)、chitin-binding protein(1879)、ricin b lectin(2380)、necrosis-inducing protein(4955)共102個蛋白進(jìn)行原核表達(dá),通過注射煙草檢測蛋白是否能引起煙草過敏反應(yīng),并通過皿內(nèi)對峙試驗檢測粗蛋白液的抑菌活性。得到以下結(jié)果:(1)gCLA4基因組大小約為7.59 Mb�；蛐蛄蠫C含量達(dá)72.36%。全基因組共6906個編碼基因,其總長度占基因組全長的86.83%。gCLA4基因序列與GO、COG、KEGG、NR數(shù)據(jù)庫比對,各有978、2363、2852、6634個基因得到功能注釋。gCLA4基因組序列經(jīng)antiSMASH分析共得到24個次級代謝生物合成基因簇,其中6個與已知基因簇相似度100%,1個相似度87%,可能合成Streptothricin、Coelichelin,具有抑菌活性。通過預(yù)測gCLA4基因組信息,共得到271個分泌蛋白,占全基因組的3.9%。其中104個蛋白有功能描述。(2)本研究對gCLA4中上述102個蛋白去信號肽后在E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),用載體pET-28a表達(dá)得到12個可溶性表達(dá)的蛋白,用載體pCold TF使74個蛋白得到可溶性表達(dá)。最終獲得可溶性表達(dá)的蛋白86個。這86個蛋白對大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae)、蘋果樹腐爛病菌03-8(Valsa mali 03-8)等靶標(biāo)菌均無抑菌活性。Necrosis-inducing protein4955能引起煙葉過敏反應(yīng),其余均無活性。(3)利用Protparam預(yù)測蛋白4955(necrosis-inducing protein)基本性質(zhì),用SWISS-MODLE模擬三維結(jié)構(gòu),并探究蛋白4955穩(wěn)定性。通過檢測蛋白4955處理后,煙草CAT、SOD、POD、PAL酶活變化和煙草防御反應(yīng)基因PR1-a、PR1-b、NPR1、LOX、PAL表達(dá)量探究其活性。結(jié)果表明蛋白4955含有225個氨基酸,分子量24491.12;等電點(diǎn)5.96。含保守結(jié)構(gòu)域NPP1。耐受溫度40℃,耐受pH 6-10,原蛋白5倍稀釋液有活性,10倍稀釋液活性較弱。蛋白4955在處理煙草后第2 d,煙草的CAT、SOD、PAL酶活增強(qiáng),第1、3、5 d煙草PR1-b、LOX基因上調(diào)表達(dá),第4 d PAL基因上調(diào)表達(dá)。表明蛋白4955能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性。(4)殼聚糖酶278、幾丁質(zhì)酶3253、4025、4203、5554、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白1879各由255、533、576、754、574、172個氨基酸組成,分子量分別為27540.71、53830.43、60100.10、80762.58、59326.23、18571.79,等電點(diǎn)分別為5.86、5.57、5.80、6.00、5.90、8.72。殼聚糖酶278含糖基水解酶46家族結(jié)構(gòu)域;幾丁質(zhì)酶3253、4025、5554為18家族幾丁質(zhì)酶,均含有糖基水解酶家族18結(jié)構(gòu)域,幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域;幾丁質(zhì)酶4203同時含有糖基水解酶家族18 II型幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域和19家族ChiC結(jié)構(gòu)域及ChiC結(jié)合結(jié)構(gòu)域;幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白1879含有溶解性多糖單加氧酶(LPMO-10)結(jié)構(gòu)域。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白與1%膠體幾丁質(zhì)40℃反應(yīng)24 h后,約有24.5%的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合。殼聚糖酶278、幾丁質(zhì)酶3253、4025、5554對殼聚糖及幾丁質(zhì)無降解活性。
[Abstract]:The results were as follows : ( 1 ) The genome size of gCLA4 was about 7.59 Mb . The results were as follows : ( 1 ) The genome size of gCLA4 was about 7.59 Mb . The results showed that protein 4955 contained 225 amino acids , molecular weight of 244912 , PAL enzyme activity and the expression of PAL gene . The results showed that protein 4955 contained 225 amino acids , molecular weight of 244912 , isoelectric point 5.96 .
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S476.1

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本文編號：2020137