本文選題：甲醛 + 基因��； 參考：《上海師范大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：甲醛(HCHO)是裝修后的主要污染物之一,對(duì)室內(nèi)環(huán)境和人體健康影響較大。植物凈化作為一種生態(tài)環(huán)保的凈化室內(nèi)空氣質(zhì)量的手段,一直被人們所關(guān)注。研究證明,利用基因工程手段增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物HCHO代謝能力可提高其吸收外源HCHO的速率和脫毒能力。HPS和PHI是許多甲基營養(yǎng)菌甲醛固定途徑RuMP的關(guān)鍵酶。本研究論文的工作:(1)從番茄中克隆了可定位在植物葉綠體細(xì)胞器的RbcS3c基因兩個(gè)長度不同啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列,并進(jìn)行元件分析和功能預(yù)測(cè);(2)分析金魚草密碼子的偏好性并對(duì)目的基因hps-phi融合序列進(jìn)行優(yōu)化后,將RbcS3c基因信號(hào)肽和hps-phi目的基因構(gòu)建到瞬時(shí)表達(dá)載體中,觀察其是否定位到葉綠體中表達(dá);(3)構(gòu)建RbcS3c基因2個(gè)長度不同啟動(dòng)子引導(dǎo)hps-phi目的基因的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株,通過定量PCR比較不同長度啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因效率,并驗(yàn)證hps-phi目的基因分解甲醛的作用;(4)建立金魚草的再生體系,獲得大量的可轉(zhuǎn)化植株。第一部分工作結(jié)果:從番茄中克隆了可定位在植物葉綠體細(xì)胞器的RbcS3c基因兩個(gè)長度不同啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列,分別命名為RbcS3cPS1和RbcS3cPS2。RbcS3cPS1片段長度為738bp,對(duì)該序列進(jìn)行測(cè)序分析并與已發(fā)表的RbcS3c基因(X05986)相應(yīng)序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):在TATA盒、CAAT盒等重要功能區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)有堿基的改變,說明所克隆片段即為番茄RbcS3c基因上游調(diào)控序列。Plant CARE軟件分析該序列表明:該基因啟動(dòng)子含有多處保守序列,而且越靠近起始密碼子區(qū)域序列越保守,該啟動(dòng)子序列除含有啟動(dòng)子必需的CAAT框、TATA框外,還含有G-box、I-box、box I、box II、ATC-motif等十二種與光響應(yīng)有關(guān)的元件。另外,還含有一個(gè)個(gè)Me JA響應(yīng)元件、一個(gè)乙烯響應(yīng)元件。將該基因啟動(dòng)子再向上游拉長后擴(kuò)增的RbcS3cPS2片段長度為1086bp序列。在從RbcS3c基因啟動(dòng)子738bp向上游延伸的300bp的序列中,發(fā)現(xiàn)這個(gè)啟動(dòng)子有很多與植物非生物脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件,如ABRE、G-BOX、HSE、GARE-MOTIF、TATC-BOX、MBS。與Gen Bank中X05986比對(duì),本研究克隆的兩個(gè)不同長度的RbcS3c基因啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列雖然在TATA-box、CAAT-box、G-box等重要功能區(qū)域沒有堿基改變,但在其他區(qū)域存在9處堿基的差異,包括8處堿基替換和1處堿基缺失,這些差異序列都存在于738bp序列中。兩者與已發(fā)表的RbcS3c基因(X05986)相應(yīng)序列同源性分別為98%和98.7%。這說明在不同番茄品種之間RbcS3c基因啟動(dòng)子序列會(huì)存在一定的差異性。第二部分工作結(jié)果:金魚草的ENc值為61,偏大,表明金魚草在密碼子的使用上偏好性不強(qiáng)。葉綠體中的密碼子使用較為均勻,除終止密碼子外,最小的為2.5,分別是蘇氨酸ACG和絲氨酸AGC,最大的是苯丙氨酸UUU,使用率在千分之53.5左右,其次是天冬酰胺千分之37.0。根據(jù)生物軟件計(jì)算結(jié)果表明,GCC、GAC、GAG、TTC等30個(gè)以C或G堿基為第3位的密碼子的RSCU值均大于l,且Frac值也較大,為hps-phi基因的偏好密碼子。據(jù)此,將甲基營養(yǎng)菌中hps-phi融合基因序列根據(jù)密碼子簡并性優(yōu)化,優(yōu)化后的序列與原序列的相似度為76%左右。通過煙草瞬時(shí)表達(dá),我們可以看到在信號(hào)肽的指導(dǎo)下,攜帶目的基因成功定位到葉綠體中。這說明我們克隆的信號(hào)肽雖然在氨基酸組成上與NCBI中報(bào)道的序列有2個(gè)氨基酸的差異,但其信號(hào)肽功能并沒有發(fā)生改變,這與生物軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。即我們克隆的信號(hào)肽與NCBI中報(bào)道的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)不同,但在功能上都可以發(fā)揮信號(hào)肽的作用。第三部分結(jié)果:分別構(gòu)建兩個(gè)由番茄RbcS3c基因不同長度啟動(dòng)子及信號(hào)肽引導(dǎo)融合基因hps-phi的表達(dá)載體:pC1301-RbcS3cP1S::hps-phi-Nos(小載體)和pC1301-RbcS3cP2S::hps-phi-Nos(大載體),并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用定量PCR檢測(cè)分別含有大、小載體轉(zhuǎn)基因煙草植株目的基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示,在含有小載體轉(zhuǎn)基因植株中,目的基因表達(dá)量平均比含有大載體轉(zhuǎn)基因植株提高20多倍。轉(zhuǎn)基因煙草植株抗甲醛能力檢測(cè)顯示,含有小載體轉(zhuǎn)基因植株非常強(qiáng),比野生型提高了約14-20倍,這也與目的基因定量檢測(cè)結(jié)果一致。目的基因定量分析以及抗甲醛能力檢測(cè)結(jié)果都表明,將啟動(dòng)子加長之后并沒有增加外源基因的表達(dá)量,反而比沒有加長的啟動(dòng)子表達(dá)量更低。由此我們推測(cè),在加長的啟動(dòng)子序列上,可能有某些功能元件抑制了該啟動(dòng)子的效率,從而使目的基因的表達(dá)量下降到幾乎沒有表達(dá)的水平。最后,我們建立了金魚草的再生體系,研究結(jié)果表明:IBA對(duì)金魚草生根的促進(jìn)作用明顯要優(yōu)于NAA,加IBA或NAA激素的培養(yǎng)基生根率明顯高于不加IBA或NAA激素的培養(yǎng)基,金魚草無根苗在附加IBA的培養(yǎng)基中生根效果最好,生根率100%,平均每根苗的生根數(shù)顯著多于NAA所誘導(dǎo)的效果。其中IBA為1.5mg/L時(shí),平均生根數(shù)達(dá)到最大值為24條左右,這與日本學(xué)者所報(bào)道的合適促進(jìn)生根的濃度一致。有關(guān)本研究構(gòu)建的兩個(gè)載體在金魚草中轉(zhuǎn)化方法還需要進(jìn)一步探索和改進(jìn)。開展本研究為今后進(jìn)一步培育高甲醛分解能力的金魚草轉(zhuǎn)基因植株奠定了主要的基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this paper , two different promoters and signal peptide sequences of RbcS3c gene were cloned from tomato . In this paper , we can see that there are some differences in the sequence of RbcS3c gene promoter . The results showed that the rooting rate of IBA was obviously better than that of NAA , IBA or NAA . The rooting rate of IBA was better than that of IBA or NAA . The rooting rate was 100 % .
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2013340