本文選題：梭梭 + 14-3-3蛋白基因　； 參考：《新疆農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文

【摘要】：14-3-3蛋白是以同源或者異源二聚體形式存在的一類保守性很高、可以多基因編碼并且具有調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)家族。在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的核定位、調(diào)控基因的表達和酶活性的調(diào)控等多種細胞活動中起到重要作用。本論文以梭梭為研究對象,采用RT-PCR方法分離并成功克隆出5個14-3-3蛋白基因,進行了生物信息學的初步分析。采用q RT-PCR方法研究5個基因在干旱脅迫下表達水平。利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法獲得了HaFT-4基因轉(zhuǎn)煙草植株,并對轉(zhuǎn)HaFT-4基因煙草進行相關(guān)分析。主要研究結(jié)果如下:1.成功克隆5個梭梭14-3-3蛋白基因,命名為HaFT-5、Ha FT-6、HaFT-7、HaFT-8和Ha FT-9。5個14-3-3蛋白基因ORF大小分別為420 bp、681 bp、789 bp、792 bp和789 bp分別編碼139、226、262、263和262個氨基酸。分別對這5個基因編碼的氨基酸序列的生物信息學進行了分析,預測得出,HaFT-5為穩(wěn)定蛋白,其余4個蛋白為不穩(wěn)定蛋白。這5個蛋白都是親水蛋白,均沒有信號肽,同時不存在跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)序列相似性比對發(fā)現(xiàn),5個14-3-3蛋白中HaFT-5與Ha FT-6與甜菜的同源性最高,HaFT-7~HaFT-9與菠菜的同源性最高,均達到90%以上。分子進化樹可以得出,HaFT-5與甜菜聚為一支,HaFT-6與葡萄和百合聚為一支,HaFT-7與Ha FT-9被聚為一支的同時均和菠菜聚為一支,HaFT-8與菠菜聚為一支。2.利用實時熒光定量對5個14-3-3蛋白基因在20%PEG6000模擬干旱脅迫處理0 h、4 h、8 h、12 h和24 h的表達量進行分析,HaFT-5基因在12 h產(chǎn)生最高表達量,后明顯下降。Ha FT-6~Ha FT-9基因均在干旱脅迫8 h有最大表達量,之后逐漸降低。HaFT-9基因的相對表達量有最顯著的變化,但是Ha FT-6基因與未脅迫時相比表達量變化不顯著。3.成功構(gòu)建了pCAMBIA1304-HaFT-4植物表達載體,用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化葉盤法將該基因轉(zhuǎn)入煙草中,獲得5株轉(zhuǎn)基因煙草植株。選擇3株轉(zhuǎn)基因植株及野生型煙草植株葉片進行干旱、鹽及低溫脅迫后分析丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和葉綠素的變化情況。結(jié)果表明,3株轉(zhuǎn)HaFT-4基因植株經(jīng)過脅迫后變化趨勢較為相似,但是3株轉(zhuǎn)HaFT-4基因煙草植株相較于野生型煙草植株的丙二醛含量降低,脯氨酸積累增加,可溶性糖含量升高,葉綠素含量也升高。綜合來看,轉(zhuǎn)Ha FT-4基因煙草對于逆境具有更強的抵御能力。
[Abstract]:14-3-3 proteins are a family of proteins with high conserved status in the form of homologous or heterodimer, which can be encoded by multiple genes and have regulatory functions. It plays an important role in regulating the nuclear localization of transcription factors, gene expression and enzyme activity. In this paper, five 14-3-3 protein genes were isolated and cloned successfully by RT-PCR, and the preliminary bioinformatics analysis was carried out. The expression level of five genes under drought stress was studied by Q RT-PCR. HaFT-4 transgenic tobacco plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The main results are as follows: 1. Five 14-3-3 protein genes of Haloxylon ammodendron were successfully cloned and named HaFT-5 Ha FT-6 HaFT-7 HaFT-8 and Ha FT-9.5 14-3-3 protein genes. The ORF sizes of these genes were 420bpn681 BP, 789 BP, 792 BP and 789 BP, respectively, encoding 1392262263 and 262 amino acids, respectively. The bioinformatics analysis of the amino acid sequences encoded by these five genes showed that HaFT-5 was a stable protein and the other four proteins were unstable proteins. All the five proteins were hydrophilic, without signal peptide and no transmembrane structure. The homology of HaFT-5 and Ha FT-6 with beet was the highest among the five 14-3-3 proteins. The homology of HaFT-7 and HaFT-9 with spinach was the highest, and the homology of HaFT-5 and Ha FT-6 was over 90%. The molecular phylogenetic tree showed that HaFT-5 and beet formed a single HaFT-6 with grape and lily, HaFT-7 and Ha FT-9 were clustered into one, while spinach and spinach were clustered into a branch of HaFT-8 and spinach into one branch of .2.The molecular evolution tree showed that HaFT-5 and sugar beet formed a branch of HaFT-6, and that of grape and lily were one branch of HaFT-7 and Ha FT-9. The expression of 5 14-3-3 protein genes in simulated drought stress of 20 PEG6000 was analyzed by real-time fluorescence quantitative analysis. The highest expression of HaFT-5 gene was observed at 12 h after treatment of 0 h, 4 h and 8 h, and 24 h, respectively. The relative expression of HaFT-9 gene decreased significantly after drought stress for 8 h, but Ha FT-6 gene had no significant change compared with that under drought stress, but the relative expression level of Ha FT-6 gene was not significantly changed compared with that of non-stress (P < 0.05), but the relative expression level of HaFT-9 gene decreased significantly after drought stress for 8 h, but the change of Ha FT-6 gene was not significant compared with that under drought stress. The plant expression vector pCAMBIA1304-HaFT-4 was successfully constructed and transformed into tobacco by Agrobacterium tumefaciens. The changes of malondialdehyde (MDA), proline, soluble sugar and chlorophyll in leaves of 3 transgenic and wild-type tobacco plants were analyzed after drought, salt and low temperature stress. The results showed that the changes of malondialdehyde (MDA) content, proline accumulation and soluble sugar content in three transgenic HaFT-4 transgenic tobacco plants were lower than those in wild type tobacco plants, but the change trend of HaFT-4 transgenic plants was similar to that of wild type tobacco plants, but the content of soluble sugar in three transgenic HaFT-4 transgenic tobacco plants was higher than that in wild type tobacco plants. Chlorophyll content also increased. In general, transgenic tobacco with Ha FT-4 gene had stronger resistance to stress.
【學位授予單位】：新疆農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S792.99;Q943.2

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本文編號：2011389