本文選題：Id3 + 肺癌��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景：肺癌是目前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。在中國(guó),肺癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì),并已成為惡性腫瘤死亡的最主要原因之一。大部分肺癌,尤其是占肺癌80%的非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)患者確診時(shí)已處于晚期,已失去了外科手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。因此,化療藥物成為治療肺癌的主要手段之一,盡管治療取得了一定的進(jìn)展,但過(guò)去25年其5年生存率仍未見明顯提高,僅為15%。在肺癌化療中,以順鉑(DDP)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療成為NSCLC的一線化療藥物,但由于耐藥性問(wèn)題使其化療效果明顯降低,這已成為目前困擾肺癌治療的一大難題。因此,尋找更為特異的針對(duì)鉑類藥物耐藥相關(guān)的分子靶點(diǎn),如何改變肺癌鉑類藥物耐藥性及耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制研究成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外臨床研究的熱點(diǎn)之一。導(dǎo)致肺癌化療失敗的主要原因之一是多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象的產(chǎn)生。MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物同時(shí)擁有固有或獲得性交叉耐藥,從而妨礙癌癥有效治療的現(xiàn)象。研究表明,腫瘤具有多種化療藥物耐藥機(jī)制,涉及細(xì)胞生物學(xué)的各個(gè)方面,是多基因、多步驟聯(lián)合作用的結(jié)果,蛋白質(zhì)-酶或細(xì)胞的部分結(jié)構(gòu)對(duì)MDR的產(chǎn)生起到關(guān)鍵性作用,另外,一些癌基因、抑癌基因以及細(xì)胞因子等也都可能參與了多藥耐藥形成的過(guò)程,其確切的耐藥形成機(jī)制尚未完全清楚,但其中研究最廣泛且具有多效性的MDR機(jī)制之一是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使細(xì)胞藥物流出。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,包括ABC蛋白家族主要成員：P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)以及肺耐藥蛋白(LRP)蛋白,通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度或者改變藥物的分布來(lái)確定MDR的表型。目前,通過(guò)使用不同種類的MDR抑制劑來(lái)干擾這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出胞外,這種方法的應(yīng)用正在不同的研究階段。人類多藥耐藥MDR基因主要有兩種亞型,即MDR1和MDR2,其中,MDR1編碼的基因產(chǎn)物是介導(dǎo)多藥耐藥產(chǎn)生的主要方式。近年來(lái),研究最廣泛的就是P-gp。 P-gp是一種的跨膜糖蛋白,分子量為170kD,由7號(hào)染色體上的MDR1基因編碼。P-gp蛋白的表達(dá)量與細(xì)胞耐藥性呈正相關(guān)性。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中P-gp蛋白的表達(dá)量要高于小細(xì)胞肺癌(SCLC),在肺腺癌中P-gp蛋白的表達(dá)量要高于其在肺鱗癌中的表達(dá),P-gp蛋白在中一高分化腺癌中表達(dá)最高,這與它們對(duì)化療藥物不敏感性程度相一致。P-gp表達(dá)高低與肺癌分期無(wú)關(guān),但與癌細(xì)胞多藥耐藥性、化療藥物的選擇以及肺癌患者的預(yù)后有著密切聯(lián)系。導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞MDR現(xiàn)象產(chǎn)生的另一主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡耐受。細(xì)胞凋亡抑制基因如Bcl-2、Survivn、突變型p53等的過(guò)表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡耐受,抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。目前,Bcl-2蛋白已成為研究最深入、同樣也是最重要的細(xì)胞凋亡抑制基因。Bcl-2基因定位于染色體18q21,在大部分癌癥患者中容易導(dǎo)致染色體t(14；18)的易位,以致Bcl-2基因定位在14q32上,與Ig重鏈的轉(zhuǎn)錄蛋白增強(qiáng)子接近,從而導(dǎo)致Bcl-2的表達(dá)增高。Bcl-2基因的表達(dá)的升高可以促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖,同時(shí)使得化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受到抑制。即使化療藥物能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),但細(xì)胞中Bcl-2基因的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,但這種損傷不能轉(zhuǎn)換成凋亡的信號(hào),以致細(xì)胞凋亡受到阻礙,因此在化療期間高表達(dá)Bcl-2的癌細(xì)胞又能以比較快的速度再次重新生長(zhǎng)增殖,導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生。在大多數(shù)SCLC中瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中,Bcl-2表達(dá)的升高,這是與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生藥物耐受有關(guān)。近期研究表明,與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)的RhoE基因也影響著腫瘤的耐藥性。RhoE基因?qū)儆诜堑湫偷腞hoGTPase家族成員之一,其一直處于活化的GTP結(jié)合狀態(tài),最近研究發(fā)現(xiàn),它在一些主要的肺癌細(xì)胞系和癌組織中的表達(dá)下調(diào),可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。RhoE具有許多重要的功能,它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞形態(tài),影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化等。分化抑制因子(Id),屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,因缺乏與DNA結(jié)合區(qū)域而對(duì)堿性HLH (bHLH)轉(zhuǎn)錄因子起負(fù)調(diào)節(jié)作用。到目前為止,在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)4種Id蛋白,即Id1、Id2、Id3和Id4。近幾年的研究表明,Id蛋白家族具有比較廣泛的生物學(xué)功能,包括：調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)和細(xì)胞定向分化、維持細(xì)胞存活、促進(jìn)血管、胚胎和器官的形成、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡及腫瘤侵潤(rùn)等癌蛋白功能,同時(shí)還具備抑制細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能。Id蛋白特別是Id1蛋白,不僅參與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,在許多腫瘤細(xì)胞中也呈現(xiàn)高表達(dá),已有研究發(fā)現(xiàn),Id1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Lwatsuki發(fā)現(xiàn),在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹腔轉(zhuǎn)移的胃癌患者中,Id1蛋白在骨髓和外周血中的表達(dá)水平要明顯高于沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者,并提出骨髓和外周血中Id1是監(jiān)測(cè)胃癌發(fā)生淋巴結(jié)和腹腔轉(zhuǎn)移的“真正的指標(biāo)”。大量研究已證實(shí)Id1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及表達(dá)程度與腫瘤細(xì)胞的分化及細(xì)胞侵襲能力相關(guān),被研究者們認(rèn)為是一種“準(zhǔn)癌基因”,因此得到學(xué)者們的廣泛研究。目前,Id1在腫瘤中發(fā)揮的生物學(xué)作用已得到普遍認(rèn)可,與Id1相比,因?yàn)镮d3基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性決定了其功能的多樣性,因此,有關(guān)Id3基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用及其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。1991年,有研究學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)了Id3基因,它被稱為體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞過(guò)程中血清誘導(dǎo)表達(dá)的立即早期基因。Id3的表達(dá)既廣泛,又有細(xì)胞類型的特異性,決定了其基因調(diào)控機(jī)理的復(fù)雜性。Id3在細(xì)胞中的表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制與Id1不完全相同,在不同種類的腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中,Id3具有截然不同的表達(dá),在人小細(xì)胞肺癌和原發(fā)性結(jié)直腸癌中表達(dá)量較高,而在前列腺癌、卵巢癌及甲狀腺癌中表達(dá)水平低下。小鼠Id3基因敲除(Id3-/-)可導(dǎo)致小鼠發(fā)生與人類相似的γδ T細(xì)胞淋巴瘤,提示γδ T細(xì)胞淋巴瘤患者體內(nèi)可能存在Id3基因的突變。在我們的前期體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：①Id3在正常人PBMC中未見表達(dá),而在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)程度則有較大差異,在人前列腺癌細(xì)胞PC-3M中Id3表達(dá)水平最高,要明顯高于肺腺癌細(xì)胞(A549)、卵巢癌細(xì)胞(COC2)、Burkitt'sB淋巴瘤細(xì)胞(Daudi). T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞(Jurkat)等；②用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)對(duì)A54、PC-3M和人乳腺上皮癌細(xì)胞(MCF7)中Id3蛋白的表達(dá)分布進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明,A549細(xì)胞內(nèi)Id3蛋白表達(dá)量要明顯低于MCF7和PC-3M細(xì)胞。以上結(jié)果表明,Id3的表達(dá)是根據(jù)其所在細(xì)胞的種類和生長(zhǎng)發(fā)育階段的不同而呈現(xiàn)不同的水平,從而執(zhí)行各種特殊的細(xì)胞生物學(xué)功能。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,Id3除了具有促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞分化的功能外,在細(xì)胞凋亡方面也發(fā)揮著極其重要的作用。早在2001年,Kee等就發(fā)現(xiàn)通過(guò)采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將Id3導(dǎo)入人B淋巴細(xì)胞前體(B lymphocyte progenitorsBLPs)內(nèi),可導(dǎo)致BLPs出現(xiàn)增殖抑制以及凋亡,通過(guò)模擬TGF-β的作用,外源性Id3在BLPs中的過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)BLPs發(fā)生凋亡現(xiàn)象。最近,Lee等研究也發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)X射線照射的小鼠表皮組織和HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Id3表達(dá)的上調(diào),Id3重組腺病毒在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,并能顯著增加X射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)：①將表達(dá)載體pEGFP/Id3導(dǎo)入A549細(xì)胞,使EGFP-Id3融合蛋白在A549細(xì)胞中得到表達(dá),MTT實(shí)驗(yàn)、Annexin V/7AAD-FCM凋亡檢測(cè)以及Hoechst 33258核染色法結(jié)果均表明,Id3轉(zhuǎn)基因表達(dá)可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生增殖抑制和凋亡；②用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建靶向人Id3基因的miPNA干擾載體(pcDNA/miRId3),體外抑制A549細(xì)胞中Id3的表達(dá),可逆轉(zhuǎn)外源性Id3表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制和致凋亡作用：③將Id3基因克隆至腺病毒表達(dá)載體pAxCAwtit,轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后制備出重組腺病毒Ad-Id3,結(jié)果表明,腺病毒介導(dǎo)的Id3轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以抑制A549細(xì)胞增殖。以上結(jié)果提示,Id3在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制和凋亡。Id作為抗腫瘤藥物所致凋亡的負(fù)性調(diào)節(jié)子,可望成為增強(qiáng)化療敏感性的新型治療靶點(diǎn)。在順鉑誘導(dǎo)肉瘤系MG63細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中,Id3的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)MG63細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性。有研究表明,Id1不僅作為肺腺癌預(yù)后判斷的標(biāo)志分子物質(zhì),而且通過(guò)下調(diào)Idl的表達(dá)可以增強(qiáng)肺腺癌放化療的敏感性,但其具體作用機(jī)制目前尚不清楚。Li等發(fā)現(xiàn),通過(guò)下調(diào)Idl的表達(dá)可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞MGC803和AGS順鉑耐藥的敏感性；同時(shí),Lee也發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)下調(diào)p53表達(dá)可以負(fù)調(diào)控PTEN蛋白,從而導(dǎo)致PI3K/Akt/Wnt信號(hào)通路的激活,引起細(xì)胞增殖的發(fā)生,故認(rèn)為PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了Idl的生物學(xué)作用,如細(xì)胞增殖、抗凋亡侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)效應(yīng)。最近研究也發(fā)現(xiàn),Id1和Id3可以作為非小細(xì)胞肺癌Ⅲ-N2期患者化療治療的預(yù)后標(biāo)志物,這兩種蛋白可能在腫瘤治療方法上發(fā)揮不同作用,尤其是腫瘤化療的治療上。順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性的細(xì)胞毒性化療藥物,其主要作用靶點(diǎn)是DNA,其主要作用機(jī)制是作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈,形成DDP-DNA復(fù)合物,干擾DNA復(fù)制或與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合,引起癌細(xì)胞DNA的復(fù)制障礙,使增殖迅速的細(xì)胞停滯在G2/M期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用。目前認(rèn)為抗癌細(xì)胞凋亡、損傷修復(fù)過(guò)程中DNA剪切物的增加、與調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的改變、藥物攝取減少導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DDP濃度降低等均可能與順鉑的耐藥有關(guān),然而肺癌細(xì)胞對(duì)其耐藥的機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為肺癌順鉑耐藥機(jī)制的研究主要在以下幾個(gè)方面：1、由藥物攝取障礙或藥物外排增加介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的降低;2、DNA損傷修復(fù)功能的異常；3、細(xì)胞解毒功能的增強(qiáng)；4、細(xì)胞凋亡的抑制等方面。因此,進(jìn)一步研究順鉑的耐藥機(jī)制和尋找新的逆轉(zhuǎn)耐藥靶點(diǎn)對(duì)于改善肺癌化療效果提高5年生存率具有重要意義。順鉑抗腫瘤作用的主要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生改變主要由于細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常,凋亡相關(guān)因子表達(dá)異常引起。我們前期研究證明：Id3的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致A549和A549/DDP細(xì)胞發(fā)生凋亡。最近研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt通路是最主要的抗凋亡通路之一,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤耐藥方面也發(fā)揮著重要作用。因此我們推測(cè)：Id3可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控肺腺癌順鉑耐藥的。因此,本課題擬以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及其順鉑耐藥細(xì)胞為主要研究對(duì)象,在細(xì)胞過(guò)表達(dá)Id3情況下,分別觀察在加入順鉑前后細(xì)胞生物學(xué)行為及對(duì)順鉑耐藥的變化,了解Id3是否與肺癌順鉑耐藥有關(guān),研究Id3的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞順鉑敏感性的影響。在此基礎(chǔ)上,初步闡明Id3調(diào)控肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥性的分子機(jī)制,為進(jìn)一步分析Id3能否成為逆轉(zhuǎn)肺腺癌順鉑耐藥的分子靶點(diǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究按以下三部分進(jìn)行：第一部分：A549/DDP細(xì)胞耐藥性分析及細(xì)胞內(nèi)Id3基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的研究目的：分析A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,以及細(xì)胞內(nèi)Id3基因和蛋白的表達(dá)水平,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：1.采用CCK-8法測(cè)定不同濃度的DDP對(duì)A549/DDP和A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度(IC50)和耐藥指數(shù)；2.采用RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)Id3在A549/DDP中mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：1.在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下,用不同濃度的DDP處理A549/DDP和A549細(xì)胞,24h后用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DDP在5μg/ml濃度時(shí)能顯著抑制A549的增殖,對(duì)A549/DDP耐藥細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用,但存在較明顯的耐受現(xiàn)象,在較高濃度(20μg/ml)時(shí)才顯示出一定的抑制作用。DDP對(duì)細(xì)胞的抑制呈濃度依賴性,根據(jù)直線回歸計(jì)算出兩株細(xì)胞對(duì)DDP的半數(shù)抑制濃度(IC50),DDP對(duì)A549細(xì)胞的IC5o為5.32μg/ml,對(duì)A549/DDP細(xì)胞的ICso為19.38μg/ml,可見A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥指數(shù)為3.64；2. RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,Id3 mRNA和蛋白質(zhì)在A549/DDP和親代A549細(xì)胞中均呈低水平表達(dá),兩株細(xì)胞無(wú)明顯差異。結(jié)論：1.DDP對(duì)親本細(xì)胞株A549和耐藥細(xì)胞株A549/DDP的抑制作用呈濃度依賴性；A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥指數(shù)為3.64；2.Id3在A549/DDP細(xì)胞中表達(dá)水平低下。第二部分：Id3基因在A549/DDP細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)及其逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性的作用研究目的：初步探討凋亡誘導(dǎo)因子Id3對(duì)A549/DDP(?)鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。方法：1.用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染技術(shù)將Id3表達(dá)載體pEGFP/Id3分別導(dǎo)入A549和A549/DDP細(xì)胞以及人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1,熒光倒置顯微鏡下觀察三組細(xì)胞內(nèi)EGFP-Id3融合蛋白表達(dá)情況,倒置顯微鏡觀察Id3基因表達(dá)前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；2.用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pEGFP/Id3分別導(dǎo)入A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞,采用熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)Id3 mRNA的表達(dá)；3.采用CCK-8法檢測(cè)Id3基因過(guò)表達(dá)對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用；4.將Id3基因?qū)階549/DDP,加入不同濃度的DDP (0.0μg/ml,1.0μg/ml, 2.0μg/ml),24h后采用Annexin V-FITC和PI雙染法和流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：1.熒光顯微鏡下觀察,未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞組中無(wú)綠色熒光,轉(zhuǎn)染pEGFP/Id3重組質(zhì)粒的各組細(xì)胞中綠色熒光主要表達(dá)于細(xì)胞核,轉(zhuǎn)染空載體pEGFP質(zhì)粒的各組細(xì)胞中綠色熒光多表達(dá)于全細(xì)胞,熒光呈彌漫狀,分布均勻,無(wú)明顯細(xì)胞漿及細(xì)胞核的差異；2. qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白細(xì)胞組及轉(zhuǎn)染空載體pEGFP組相比,轉(zhuǎn)染pEGFP/Id3組A549/DDP細(xì)胞中Id3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P0.05)；3.CCK-8結(jié)果顯示,Id3基因?qū)階549/DDP細(xì)胞后,DDP對(duì)A549/DDP的半數(shù)抑制濃度(ICso)由19.38降至11.71,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.66倍；4. Annexin V-FITC和PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,與空載體pEGFP對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染PEGFP/Id3組A549/DDP細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.05),且隨DDP濃度的增高凋亡率隨之增加,提示Id3基因與DDP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)具有協(xié)同作用。結(jié)論：Id3基因與DDP對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)具有協(xié)同作用,Id3基因過(guò)表達(dá)后耐藥的A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性明顯增加,細(xì)胞凋亡增多,耐藥得以部分逆轉(zhuǎn)。第三部分：Id3逆轉(zhuǎn)A549/DDP順鉑耐藥性的作用機(jī)制分析目的：探討Id3逆轉(zhuǎn)A549/DDP頂鉑耐藥性可能作用機(jī)制。方法：1. Western blot法和qRT-PCR法檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞中多藥耐藥蛋白MDR、 RhoE和Bcl-2蛋白表達(dá),以及Akt磷酸化的變化；2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞多藥耐藥蛋白MDR含量的變化。結(jié)果：1. qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,Id3基因轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞中腫瘤耐藥相關(guān)基因MDR和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.05)；2. Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,Id3轉(zhuǎn)染基因A549/DDP細(xì)胞中腫瘤耐藥相關(guān)基因MDR和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),而RhoE的表達(dá)量明顯升高(P0.05)；3.Western blot法檢測(cè)也發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,Id3基因轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)量明顯下降(P0.05),提示Id3可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性,抑制細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性,并且Id3在此通路中具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞多藥耐藥蛋白MDR含量的變化發(fā)現(xiàn),與空載體pEGFP轉(zhuǎn)染組相比,Id3轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞中MDR蛋白含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與Vestern blot檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論：Id3可逆轉(zhuǎn)A549/DDP對(duì)順鉑的耐藥性,其機(jī)制可能與抑制藥物外排,負(fù)調(diào)控腫瘤耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2011333