本文選題：中華絨螯蟹 + 配子發(fā)生　； 參考：《華東師范大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹,是我國(guó)重要水產(chǎn)養(yǎng)殖物種,與哺乳動(dòng)物相比,中華絨螯蟹需要更加復(fù)雜的環(huán)境來(lái)誘導(dǎo)其交配、排卵,因此中華絨螯蟹具有獨(dú)特的生殖調(diào)控機(jī)制。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,中華絨螯蟹的性早熟現(xiàn)象常會(huì)給生產(chǎn)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。因此,探究中華絨螯蟹配子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制不僅可以為闡明中華絨螯蟹生殖發(fā)育提供依據(jù),豐富無(wú)脊椎動(dòng)物生殖發(fā)育調(diào)控內(nèi)容,而且可以為中華絨螯蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。配子中RNA的作用主要是調(diào)控配子的正常形成、維持配子功能及在受精和胚胎形成過程中發(fā)揮作用。RNA的功能主要依賴于它的結(jié)構(gòu),特別是RNA的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu),是RNA行使其功能的最關(guān)鍵因素。DEAD-box家族基因是一類ATP依賴的RNA解旋酶,可以利用ATP水解釋放的能量有效修復(fù)錯(cuò)誤折疊的RNA結(jié)構(gòu),保證RNA的正確折疊,其參與了RNA代謝的幾乎全部過程,包括RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA前體的剪切、核糖體的生物合成、RNA的核輸出、翻譯的起始、細(xì)胞器RNA的代謝、RNA的降解和儲(chǔ)存等。因此,該家族基因與配子發(fā)生具有密切關(guān)系。此外,卵黃發(fā)生是甲殼動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟的必要條件,是卵巢發(fā)育的關(guān)鍵,直接影響甲殼動(dòng)物的繁殖力及后代幼體的數(shù)量和質(zhì)量,卵黃發(fā)生主要是卵黃蛋白原VTG的合成和攝取,因此,本研究主要探究DEAD-box家族及相關(guān)基因?qū)ε渥影l(fā)生和VTG表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。主要內(nèi)容包括：(1)中華絨螯蟹配子發(fā)生相關(guān)基因DDX6在mRNA和蛋白水平表達(dá)的組織差異性、性腺發(fā)育特異性及亞細(xì)胞水平分布分析；(2)中華絨螯蟹精子發(fā)生相關(guān)基因DDX52在mRNA和蛋白水平表達(dá)的組織差異、性腺發(fā)育過程特異性及亞細(xì)胞水平分布分析；(3)FOXL2基因?qū)χ腥A絨螯蟹卵巢成熟時(shí)期卵黃蛋白原VTG表達(dá)的調(diào)控。主要結(jié)果如下：1.根據(jù)已經(jīng)獲得的中華絨螯蟹精巢和副性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過PCR和RACE PCR克隆獲得調(diào)控配子發(fā)生相關(guān)基因DDX6、DDX52、FOXL2和FTZ-F1的cDNA全長(zhǎng)序列以及DDX20 cDNA部分序列(DDX6 cDNA全長(zhǎng)1799bp, ORF 1536bp,編碼512個(gè)氨基酸；FOXL2 cDNA全長(zhǎng)1336bp, ORF 1050bp,編碼349個(gè)氨基酸；FTZ-F1 ORF 1512 bp,編碼504個(gè)氨基酸；DDX52 cDNA全長(zhǎng)2225bp, ORF 1635bp,編碼544個(gè)氨基酸；已獲得的DDX20序列1440bp,編碼479個(gè)氨基酸)。2.應(yīng)用qRT-PCR、western blot和IHC技術(shù)分析DDX6 mRNA和蛋白水平表達(dá)模式和分布。發(fā)現(xiàn)DDX6 mRNA在精巢和卵巢中表達(dá)量較高,在其他組織中表達(dá)量均較低；在精巢發(fā)育過程中,DDX6 mRNA表達(dá)量從7月開始逐漸增加,在10月達(dá)到最高,然后逐漸降低；在卵巢發(fā)育過程中,DDX6 mRNA表達(dá)量在初級(jí)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期明顯高于成熟前期。DDX6蛋白在精巢和卵巢中均有表達(dá),精巢中主要分布在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,精細(xì)胞中分布較少；卵巢中主要分布在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。3.應(yīng)用qRT-PCR、ISH、western blot和IF技術(shù)分析DDX52 mRNA和蛋白水平表達(dá)模式和分布。發(fā)現(xiàn)DDX52 mRNA在卵巢、副性腺和精巢中表達(dá)量較高,在血淋巴、心、肌肉、胃和胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量較低；在精巢發(fā)育過程中,DDX52 mRNA表達(dá)量在8月和次年1月最高；DDX52 mRNA主要分布在精原細(xì)胞的細(xì)胞核中；在精母細(xì)胞期,幾乎檢測(cè)不到DDX52 mRNA的表達(dá)；在精子形成時(shí)期,DDX52 mRNA主要分布在精細(xì)胞的細(xì)胞核中,少量分布在后期精細(xì)胞的頂體帽和頂體管中。DDX52蛋白在肌肉、副性腺、卵巢、心、鰓和精巢中均有表達(dá),其中在精巢中表達(dá)量最高；與mRNA表達(dá)模式一致,DDX52蛋白表達(dá)量在8月精細(xì)胞期達(dá)到最高；在精巢發(fā)育過程中,DDX52蛋白主要分布在精子發(fā)生早期精原細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,精子形成早期和中期精細(xì)胞的細(xì)胞核中；精子形成后期精細(xì)胞的前頂體囊中。4.qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示DDX20、FOXL2和FTZ-F1 mRNA和蛋白均在卵巢組織中表達(dá)量最高；在卵巢發(fā)育成熟期,JOXL2、DDX20和FTZ-F1 mRNA水平逐漸上升,而VTG mRNA水平逐漸降低；隨著凋亡誘導(dǎo)劑Etoposide注射濃度的增加,濾泡細(xì)胞中FOXL2和DDX20 mRNA和蛋白水平表達(dá)量有上升趨勢(shì)；并且CO-IP證明FOXL2與DDX20蛋白間的相互作用；此外,隨著摘除單側(cè)眼柄處理時(shí)間的增加,FOXL2、DDX20、FTZ-F1和FTG mRNA表達(dá)水平逐漸上升,并且FOXL2、DDX20和FTZ-F1 mRNA具有相同的表達(dá)模式；最后CO-IP證明FOXL2通過其forkhead domain與FTZ-F1蛋白相互作用。綜上所述,本研究應(yīng)用qRT-PCR, IF, IHC, western blot和CO-IP等技術(shù)研究了中華絨螯蟹中調(diào)控生殖的相關(guān)基因,其中DDX6參與調(diào)控配子發(fā)生過程,主要調(diào)控卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)；DDX52參與調(diào)控精子發(fā)生過程中有絲分裂和精子形成,可能在后續(xù)精卵融合和胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；在卵巢發(fā)育成熟時(shí)期,FOXL2一方面與DDX20相結(jié)合調(diào)控濾泡細(xì)胞的凋亡,阻止卵母細(xì)胞通過濾泡細(xì)胞從血淋巴中吸取VTG,另一方面,FOXL2與FTZ-F1相結(jié)合可能參與調(diào)控P450芳香化酶的表達(dá),調(diào)控類固醇激素的合成,控制肝胰腺釋放VTG。
[Abstract]:In this study , it is important to study the mechanism of RNA interference . In addition , the mechanism of RNA interference is mainly dependent on its structure , especially the secondary and tertiary structure of RNA .
( 2 ) The expression of DDX52 gene DDX52 mRNA and protein level in the spermary of the crab crab , the specificity of the sex gland development and the analysis of sub - cell level distribution ;
( 3 ) The main results were as follows : 1 . The cDNA full - length cDNA sequence of DDX6 , DDX52 , FoxL2 and FTZ - F1 was obtained by PCR and RACE PCR cloning , and the full length of DDX6 cDNA was 1799bp , ORF 1536bp and 512 amino acids were encoded by PCR and RACE PCR .
The total length of FoxL2 cDNA is 1336bp , ORF is 1050bp , and 349 amino acids are encoded .
FTZ - F1 ORF 1512 bp encoding 504 amino acids ;
The cDNA length of DDX52 cDNA is 2225bp , ORF 1635bp and encodes 544 amino acids .
宸茶幏寰楃殑DDX20搴忓垪1440bp,緙栫爜479涓皚鍩洪吀).2.搴旂敤qRT-PCR,western blot鍜孖HC鎶，

本文編號(hào)：1999672