本文選題：藥物性肝損傷 + HepG2細(xì)胞　； 參考：《華南理工大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：在新藥研發(fā)和臨床用藥過程中,評估藥物性肝損傷是一個重要的命題。原代肝細(xì)胞是進(jìn)行體外肝代謝研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但因來源稀少、表型不穩(wěn)定及個體差異顯著等原因,其應(yīng)用受到了很大的限制。來源于肝臟組織的肝癌細(xì)胞系則因藥物代謝酶表達(dá)水平較低而無法準(zhǔn)確地預(yù)測或評估藥物性肝損傷。為了克服這一限制,本研究運用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定高效表達(dá)CYP3A4代謝酶的轉(zhuǎn)基因HepG2細(xì)胞。通過PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),CYP3A4代謝酶編碼基因被成功導(dǎo)入HepG2細(xì)胞。結(jié)合抗性篩選、流式分選技術(shù)、有限稀釋法和克隆環(huán)技術(shù),本研究獲得了20株穩(wěn)定表達(dá)CYP3A4的HepG2單克隆細(xì)胞。通過對其中三株單克隆細(xì)胞進(jìn)行mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和代謝活性的鑒定發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞系的CYP3A4表達(dá)水平和代謝活性相比于野生型HepG2細(xì)胞明顯提高。選取mRNA相對表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞系HepG/PB3A4.10進(jìn)行持續(xù)傳代培養(yǎng),研究其CYP3A4表達(dá)的長期穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,HepG/PB3A4.10持續(xù)培養(yǎng)40代后,仍然具有顯著高于野生型HepG2細(xì)胞的CYP3A4表達(dá)水平和代謝活性,且不同代數(shù)(P20、P30、P40)轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞系間的CYP3A4表達(dá)水平和代謝活性并未呈現(xiàn)顯著差異。隨后,本研究以HepG/PB3A4.10細(xì)胞為基礎(chǔ)通過MTT法測定兩種生物活性化合物(曲格列酮和對乙酰氨基酚)以及兩種非生物活性化合物(蔗糖和半乳糖胺)的細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過生物活性藥物處理后的HepG/PB3A4.10細(xì)胞存活率明顯減少,顯著低于野生型HepG2細(xì)胞。此外,與已有的文獻(xiàn)報道相比,本研究所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞系對曲格列酮和對乙酰氨基酚的代謝毒性更加敏感。簡而言之,本研究利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)成功快速構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)CYP3A4代謝酶的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞系,且所獲轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞系對CYP3A4介導(dǎo)的藥物肝毒性具有高度敏感性。該細(xì)胞系為臨床前藥物研發(fā)提供了一個可篩查CYP3A4介導(dǎo)的潛在肝毒性的體外研究模型。與此同時,本研究中采用的PiggyBac轉(zhuǎn)座子方法提示了一種在用于研究藥物性肝損傷的體外細(xì)胞模型中實現(xiàn)兩種或兩種以上P450酶長期穩(wěn)定表達(dá)的有效途徑。
[Abstract]:Evaluation of drug-induced liver injury is an important proposition in the process of new drug development and clinical use. Primary hepatocytes are the "gold standard" for the study of liver metabolism in vitro, but their application is limited because of their rare sources, unstable phenotypes and significant individual differences. Liver cancer cell lines derived from liver tissues can not accurately predict or evaluate drug-induced liver injury due to the low expression of drug metabolizing enzymes. In order to overcome this limitation, transgenic HepG2 cells expressing CYP3A4 metabolic enzyme stably and efficiently were constructed by PiggyBac transposon system. CYP3A4 metabolic enzyme encoding gene was successfully transfected into HepG2 cells by PiggyBac transposition subsystem. Combined with resistance screening, flow sorting, limited dilution and cloning technique, 20 HepG2 cells stably expressing CYP3A4 were obtained. The expression of CYP3A4 mRNA, protein expression and metabolic activity of three of them were significantly higher than those of wild type HepG2 cells, the expression level and metabolic activity of CYP3A4 in transgenic liver cell lines were significantly higher than those in wild type HepG2 cells. The transgenic liver cell line HepG / PB3A4.10 with the highest relative mRNA expression was selected for continuous passage culture to study the long-term stability of CYP3A4 expression. The results showed that the CYP3A4 expression and metabolic activity of HepG / PB3A4.10 were still significantly higher than those of wild type HepG2 cells after 40 generations of continuous culture, and there was no significant difference in CYP3A4 expression and metabolic activity among different generations of P20P30 P40). Subsequently, the cytotoxicity of two bioactive compounds (trioglitazone and paracetamol) and two non-bioactive compounds (sucrose and galactosamine) were determined by MTT assay based on HepG / PB3A4.10 cells. It was found that the survival rate of HepG / PB3A4.10 cells treated with bioactive drugs was significantly lower than that of wild type HepG2 cells. In addition, the transgenic liver cell lines were more sensitive to the metabolic toxicity of trioglitazone and acetaminophen. In short, a transgenic liver cell line stably expressing CYP3A4 metabolic enzyme was successfully constructed by using the PiggyBac transposition subsystem, and the obtained transgenic liver cell line was highly sensitive to CYP3A4-mediated hepatotoxicity. The cell line provides an in vitro model for screening CYP3A4 mediated potential hepatotoxicity for preclinical drug development. At the same time, the PiggyBac transposon method used in this study suggests an effective way to achieve the long-term stable expression of two or more P450 enzymes in a drug-induced liver injury model in vitro.
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575

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本文編號：1999594