本文選題：Fidgetin(Fign) + Kinesin-12�。� 參考：《南通大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:微管的聚合與解聚在許多生物過(guò)程中起著重要的作用,如細(xì)胞的分裂、遷移、膜骨架的重構(gòu)等。Fidgetin(Fign)是一種微管依賴(lài)的切割蛋白,可以通過(guò)調(diào)控微管的動(dòng)態(tài)變化來(lái)促進(jìn)有絲分裂染色體的分離。之前的研究發(fā)現(xiàn),Fign在終末分化的神經(jīng)元中也存在表達(dá),可以通過(guò)調(diào)控微管的運(yùn)動(dòng)和組裝,參與神經(jīng)發(fā)育。然而關(guān)于Fign蛋白發(fā)揮功能的位置、方式及其分子機(jī)制尚未清楚,甚至是否在神經(jīng)系統(tǒng)的其他類(lèi)型細(xì)胞中表達(dá)目前還未知。在本研究中,我們采用離體培養(yǎng)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)干預(yù)Fign表達(dá),觀察Fign蛋白對(duì)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響及其可能地分子機(jī)制。方法:分離提取大鼠生后發(fā)育不同時(shí)間脊髓組織總蛋白,采用Western bloting方法檢測(cè)微管切割蛋白Fign和Spastin表達(dá)變化。分離獲取出生后1天大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞,純化培養(yǎng)傳至第二代(P2),轉(zhuǎn)染Fign si RNA敲降其表達(dá)。采用Ed U方法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響,采用Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)及活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察等方法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞遷移的影響,采用q RT-PCR、Western-Bloting、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)(IF)方法檢測(cè)Fign在細(xì)胞中定位及含量變化;通過(guò)si RNA/IF及Overexpression/IF方法檢測(cè)細(xì)胞中微管骨架的變化。結(jié)果:1.通過(guò)Western-Bloting方法檢測(cè),在大鼠生后發(fā)育過(guò)程中,其脊髓組織中Fign和Spastin蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)。2.在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fign si RNA作用3d后,檢測(cè)對(duì)細(xì)胞遷移和增殖的影響,結(jié)果表明:與轉(zhuǎn)染對(duì)照si RNA相比,敲降Fign表達(dá)后,星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力顯著下降,而細(xì)胞增殖未受到明顯影響。3.在星形膠質(zhì)細(xì)胞中敲降Fign表達(dá)后,進(jìn)行IF檢測(cè),結(jié)果顯示:與對(duì)照si RNA相比,Fign si RNA處理組的星形膠質(zhì)細(xì)胞中微管在細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)處發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)彎(curling)。4.采用微管蛋白翻譯后修飾的不同抗體進(jìn)行Western Blotting和IF檢測(cè),結(jié)果表明:在星形膠質(zhì)細(xì)胞中干擾Fign表達(dá),酪氨酸化的微管蛋白量升高,反之若過(guò)表達(dá)Fign,酪氨酸化的微管蛋白量下降。5.我們之前已經(jīng)證明微管依賴(lài)的馬達(dá)蛋白Kinesin-12表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移,當(dāng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中同時(shí)敲降Fign和Kinesin-12表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),Fign表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移抑制可以被部分解除。結(jié)論:隨著大鼠生后發(fā)育成熟,脊髓組織中微管切割蛋白Fign和Spastin蛋白表達(dá)量逐漸下降,提示脊髓組織中的微管穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)。在體外培養(yǎng)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中微管切割蛋白Fign偏好作用于動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定酪氨酸化的微管蛋白;若下調(diào)Fign蛋白的表達(dá)水平可以顯著抑制細(xì)胞的遷移,其原因可能是由于切割蛋白失功能,微管延伸能力增強(qiáng),但受到細(xì)胞膜限制(即皮質(zhì)區(qū)actin逆行流限制),微管在細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)邊緣處的走向發(fā)生改變,原來(lái)垂直于細(xì)胞膜邊緣的微管發(fā)生沿著細(xì)胞膜邊緣的彎曲;而當(dāng)同時(shí)抑制微管依賴(lài)的馬達(dá)蛋白Kinesin-12表達(dá)時(shí),kinesin-12對(duì)微管的限制作用減弱,表現(xiàn)為更多微管垂直于細(xì)胞膜邊緣,原來(lái)被抑制的細(xì)胞遷移被部分解除。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of Fign protein on proliferation of rat spinal cord astrocytes by means of Western Blotting and Western Blotting . The expression of Fign and Kinesin - 12 in spinal cord tissue of rat spinal cord tissue was decreased .
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q42

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本文編號(hào)：1998968