發(fā)布時(shí)間：2018-06-06 15:23

  本文選題：Exendin-4 + Toll樣受體4　； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:(1)從增殖、凋亡和成骨礦化等方向研究高糖環(huán)境是否對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化發(fā)揮損傷作用,建立成骨細(xì)胞糖毒性損傷模型;(2)觀察新型降糖藥物內(nèi)源性胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物Exendin-4能否在體外發(fā)揮對(duì)成骨細(xì)胞糖毒性損傷的保護(hù)作用;(3)初步探討Exendin-4改善成骨細(xì)胞糖毒性損傷與TLR-4/NF-κB信號(hào)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。方法:(1)以小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1 subclone 14)作為研究對(duì)象,應(yīng)用含33mmol/L葡萄糖的α-MEM完全培養(yǎng)基干預(yù)成骨細(xì)胞24小時(shí),建立成骨細(xì)胞糖毒性損傷細(xì)胞模型,以含不同濃度(0、25、50、100nmol/L)的α-MEM完全培養(yǎng)基在不同時(shí)間段(0、24、48、72h)干預(yù)成骨細(xì)胞;驗(yàn)證糖毒性損傷模型的建立是否成功,體外觀察Exendin-4對(duì)成骨細(xì)胞糖毒性損傷的保護(hù)作用以及對(duì)TLR-4/NF-κB信號(hào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響。(2)MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖率,流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)成骨細(xì)胞的凋亡率;茜素紅染色法用來檢測(cè)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成;RT-PCR及Western blot法檢測(cè)成骨細(xì)胞TLR4/NF-κB基因、成骨相關(guān)基因BMP-2和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(p ERK-1/2,CHOP,Caspase12)的表達(dá),ELISA法檢測(cè)成骨細(xì)胞分泌蛋白OCN及ALP的表達(dá)。結(jié)果:(1)高糖環(huán)境中(33mmol/L)成骨細(xì)胞的增殖率顯著下降(p0.05),凋亡率顯著增加(p0.05)。Exendin-4在干預(yù)時(shí)間內(nèi)可呈時(shí)間和劑量依賴性改善成骨細(xì)胞糖毒性損傷導(dǎo)致的增殖率的下降及凋亡率的升高(均p0.05);(2)高糖環(huán)境中(33mmol/L)成骨細(xì)胞的礦化速率顯著降低(p0.05),上清液中成骨細(xì)胞分泌蛋白OCN和ALP的表達(dá)顯著降低(均p0.05)。Exendin-4在干預(yù)時(shí)間內(nèi)可改善成骨細(xì)胞糖毒性損傷導(dǎo)致的成骨礦化速率的下降及分泌蛋白(OCN,ALP)表達(dá)的下降(均p0.05);(3)高糖環(huán)境中(33mmol/L)成骨細(xì)胞內(nèi)慢性低度炎癥相關(guān)基因TLR4/NF-κB及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因(p ERK-1/2,CHOP,Caspase12)m RNA和蛋白的表達(dá)均顯著增加(均p0.05);成骨相關(guān)基因BMP2 m RNA和蛋白的表達(dá)顯著降低(p0.05)。Exendin-4下調(diào)糖毒性損傷導(dǎo)致的TLR4/NF-κB,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(p ERK-1/2,CHOP,Caspase12)表達(dá)的增加,并且可上調(diào)成骨相關(guān)基因BMP-2m RNA和蛋白表達(dá)的下降(均p0.05)。結(jié)論:高糖環(huán)境可干擾成骨細(xì)胞的增殖和分化,并且通過激活成骨細(xì)胞內(nèi)的多種炎癥通路對(duì)成骨細(xì)胞造成損傷。而Exendin-4可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)和拮抗內(nèi)置網(wǎng)應(yīng)激從而發(fā)揮對(duì)成骨細(xì)胞糖毒性損傷的保護(hù)作用。
[Abstract]:Objective: to study whether high glucose environment may damage the proliferation and differentiation of osteoblasts from the aspects of proliferation, apoptosis and osteogenesis mineralization. To observe whether Exendin-4 (Exendin-4), an endogenous glucagon like peptide, can protect osteoblast from glucose toxicity injury in vitro and to explore the effect of Exendin-4 on the improvement of osteoblasts. Relationship between cytotoxic injury and TLR-4 / NF- 魏 B signal and endoplasmic reticulum stress. Methods subclone 14 MC3T3-E1 subclone 14 of mouse precranial bone cells was used as the study object. The osteoblasts were treated with 偽 -MEM complete medium containing 33 mmol / L glucose for 24 hours to establish the model of glucose toxicity injury of osteoblasts. Osteoblasts were interfered with 偽 -MEM complete medium containing different concentrations of 25, 50, 100 nmol / L at different times for 72 h) to verify whether the model of glucose toxicity injury was successful or not. To observe the protective effect of Exendin-4 on glucose toxicity of osteoblasts in vitro and the effect on TLR-4 / NF- 魏 B signal and endoplasmic reticulum stress-related gene expression. The proliferation rate of osteoblasts was detected by MTT, the apoptosis rate of osteoblasts was detected by flow cytometry and Tunel. Alizarin red staining was used to detect the formation of mineralized nodules in osteoblasts by RT-PCR, and the expression of osteoblast TLR4 / NF- 魏 B gene, osteoblast-associated gene BMP-2 and endoplasmic reticulum stress-related protein (ERK-1 / 2CHOPS-Caspase12) was detected by Western blot. The expression of OCN and ALP in osteoblasts was detected by Elisa. Results (1) the proliferation rate of osteoblasts decreased significantly in high glucose environment (P < 0.05). The apoptosis rate of osteoblasts was significantly increased in a time-and dose-dependent manner. The apoptosis rate of osteoblasts induced by glucose toxicity injury was improved in a time-and dose-dependent manner. The mineralization rate of osteoblasts in high glucose environment decreased significantly, while the expression of OCN and ALP in supernatant decreased significantly. Decreased osteogenic mineralization rate and decreased expression of secretory protein (OCN-ALP) in osteoblasts in high glucose environment (p0.05 / L). The expression of TLR4 / NF- 魏 B and ERK-1 / 2CHOPCaspase12m mRNA and protein in osteoblasts were significantly increased in high glucose environment. The expression of TLR4 / NF- 魏 B and ERK-1 / 2CHOPCaspase12m mRNA and protein were significantly increased in osteoblasts. The expression of BMP2 mRNA and protein significantly decreased the increase of TLR4 / NF- 魏 B, endoplasmic reticulum stress-related protein (ERK-1 / 2CHOPN Caspase12) induced by glucose toxicity injury. The expression of BMP-2m mRNA and protein was up-regulated (P 0.05). Conclusion: high glucose environment can interfere with the proliferation and differentiation of osteoblasts and damage osteoblasts by activating many inflammatory pathways in osteoblasts. Exendin-4 may protect osteoblast from glucose toxicity by inhibiting TLR4 / NF- 魏 B signal and antagonizing built-in reticulum stress.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：1987146