本文選題：甘藍型油菜 + 細胞質(zhì)雄性不育��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：波里馬細胞質(zhì)雄性不育(pol CMS)是甘藍型油菜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑之一,同時也是研究核質(zhì)互作的良好載體。本研究通過圖位克隆的方法分離了波里馬細胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)基因Rfp,并利用細胞學(xué)和分子生物學(xué)方法對其進行了相關(guān)研究,闡述了Pol CMS的敗育機理及Rfp基因在甘藍型油菜中的恢復(fù)功能。主要研究結(jié)果如下:1.利用不育系6330A和恢復(fù)系Bing409構(gòu)建的回交群體通過圖位克隆的方法將波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因(Rfp)定位到甘藍型油菜A9染色體上一段長約32kb的區(qū)間。對定位區(qū)間中的orf進行序列分析發(fā)現(xiàn)其中一個為PPR家族成員,將之作為候選基因構(gòu)建載體。遺傳轉(zhuǎn)化證明該orf確實是波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因(Rfp)。2.對該基因的全長(包括啟動子區(qū),CDS和3,UTR)在不育系1141A和恢復(fù)系Bing409中進行比較測序,比較測序結(jié)果表明Rfp與rfp啟動子區(qū)和3,UTR區(qū)分別個有一個SNP,而在CDS上存在45個SNP,導(dǎo)致30個氨基酸的改變,其中12個氨基酸的極性發(fā)生變化。亞細胞定位的結(jié)果顯示Rfp和rfp均定位于線粒體。這表明恢復(fù)基因與其等位基因功能的差異主要是由于CDS區(qū)的變異導(dǎo)致,但這些變異并未引起蛋白定位的改變�；谏鲜龅臏y序結(jié)果,開發(fā)了針對Rfp的功能標(biāo)記,可以高效地用于波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)材料的篩選和恢復(fù)系的回交選育。3.半薄切片結(jié)果表明不育單株花藥在發(fā)育至第5期不能形成四個正常的角隅,向后發(fā)育也不能形成藥室或者形成1-2個形態(tài)異常的藥室,而形成的藥室中小孢子的發(fā)育異常,最終不能形成花粉或者產(chǎn)生干癟的花粉。透射電鏡結(jié)果表明不育單株在花藥發(fā)育的第3期線粒體開始出現(xiàn)異常和崩解,可能引發(fā)孢原細胞的PCD,最終導(dǎo)致L2層細胞不能分化出正常的藥室內(nèi)壁,中層,絨氈層以及小孢子母細胞。4.對Rfp基因進行RT-PCR和qPCR分析,結(jié)果表明Rfp油菜的根、莖、葉、花和幼蕾各個組織中廣泛表達,幼蕾中表達量最高,GUS分析結(jié)果與之類似,說明恢復(fù)基因可能主要在花藥發(fā)育早期起重要功能。在花藥中GUS染色結(jié)果表明Rfp表達的主要部位在L2層細胞特化出的藥室內(nèi)壁,中層,絨氈層以及小孢子母細胞(小孢子)中,這與不育表型相對應(yīng)。5.為了探究Rfp可能的功能,以pol胞質(zhì)(不育系)和nap胞質(zhì)(保持系)線粒體組差異的orf作為探針進行Northern blot的檢測。其中以orf224作為探針檢測時發(fā)現(xiàn)在與不育系相比遺傳轉(zhuǎn)化復(fù)育系和恢復(fù)系中orf224-atp6轉(zhuǎn)錄本發(fā)生明顯減少,而保持系中基本檢測不到信號。這表明Rfp可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式參與orf224轉(zhuǎn)錄本的加工從而恢復(fù)育性。6.對Rfp進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)其具有15個PPR結(jié)構(gòu)域,可能與RNA識別相關(guān),但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的結(jié)構(gòu)域,據(jù)此推測可能還存在其他未知蛋白參與該過程。通過酵母雙雜,在甘藍型油菜花蕾cDNA文庫中共篩選到了4個可能與Rfp互作的基因,通過BiFC的檢測證實這些互作在甘藍型油菜的線粒體中真實存在。對這些互作的基因進行了干涉,它們的具體功能需進一步研究。
[Abstract]:The cytoplasmic male sterility (pol CMS) is one of the main ways to utilize the Heterosis of Brassica napus, and it is also a good carrier for the study of nuclear interaction. In this study, the fertility restorer gene Rfp of the cytoplasmic male sterility of bolma cytoplasmic male sterility was isolated by the method of graph cloning, and was carried out by cytological and molecular biological methods. The mechanism of abortion of Pol CMS and the recovery function of Rfp gene in Brassica napus were discussed. The main results were as follows: 1. the backcross group constructed by the sterile line 6330A and the restorer line Bing409 could locate the BMS cytoplasmic male sterility restorer gene (Rfp) on the A9 chromosome of Brassica napus by using the method of mapping the clone of the cytoplasmic male sterile (Rfp). A section of a length of about 32KB. The sequence analysis of orf in the positioning interval found that one of them was a member of the PPR family as a candidate gene construction carrier. Genetic transformation proved that the ORF was indeed the full length of the ORF cytoplasmic male sterility restorer gene (Rfp).2. (including the promoter region, CDS and 3, UTR) in the sterile line 1141A and The comparative sequencing in the restorer line Bing409 showed that there was a SNP in the promoter region of Rfp and RFP and 3 and UTR, and 45 SNP in CDS, which resulted in the change of 30 amino acids, and the polarity of 12 amino acids changed. The result of subcellular localization showed that both Rfp and RFP were located in the mitochondria. The difference in the function of the allele is mainly due to the variation in the CDS region, but these variations do not cause the change in the protein location. Based on the above sequencing results, a functional marker for Rfp is developed, which can be used efficiently for the screening of the restorer material of the cytoplasmic male sterility and the backcross breeding of the.3. semi thin section. The results showed that the anther of sterile single plant could not form four normal corners in the period of development to fifth stage, and the backward development could not form the medicine chamber or form the 1-2 morphologically abnormal pharmacy, and the development of the medium and small spores in the medicine chamber was abnormal and eventually could not form pollen or produce shrivelled flower powder. Transmission electron microscopy showed that the sterile single plant was in anther hair. The third stage mitochondria began to appear abnormal and disintegrating, which could lead to the PCD of the sporospora cells, which eventually led to the failure of the L2 layer cells to differentiate into the normal chamber wall, the middle layer, the tapetum and the microspore mother cell.4. to RT-PCR and qPCR analysis of the Rfp gene. The results showed that the roots, stems, leaves, flowers and young buds of the Rfp rape were widely expressed. The expression of the young buds was the highest, and the results of GUS analysis were similar, indicating that the restorer gene might play an important role in the early stage of anther development. In the anther, the results of GUS staining showed that the main parts of the Rfp expression were in the inner wall of the chamber, the middle layer, the tapetum and the microspore cells (microspore), which were corresponding to the sterile phenotype. 5. in order to explore the possible function of Rfp, the Northern blot was detected by ORF as a probe with the difference between the pol cytoplasmic (sterile line) and the nap cytoplasmic (maintainer) mitochondrial group. The orf224 as a probe detected a significant decrease in the orf224-atp6 transcript in the genetic transformation lines and the restorer lines compared with the male sterile lines, and in the maintainer line. The signal is not detected basically. This indicates that Rfp may be involved in the processing of orf224 transcriptional transcript by post transcriptional regulation to restore the fertility.6. to predict Rfp and find that it has 15 PPR domains, which may be associated with RNA recognition, but it itself does not have a RNA shear or other processing domain, thus speculates that there may still be other failure. In this process, 4 genes interacting with Rfp were screened in the cDNA Library of Brassica napus by yeast double heterozygosity. The interaction of these interactions in the mitochondria of Brassica napus was confirmed by BiFC detection. The genes of these interacted genes were interfered, and their specific functions needed further study.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4

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本文編號：1983799