本文選題：錯(cuò)配修復(fù)基因 + MLH1��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的人DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)系統(tǒng)在維持基因組穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用。MMR功能障礙導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)與許多惡性腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系,例如Lynch綜合征。此外,約15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)也與MMR功能障礙相關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)證實(shí)雌激素替代治療對(duì)結(jié)直腸癌患者具有保護(hù)性作用。我們的前期研究表明,雌激素的這一作用可能與DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1有關(guān)。MLH1是體內(nèi)最重要的MMR基因之一。然而,雌激素如何調(diào)節(jié)錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的機(jī)制,以及通過(guò)雌激素信號(hào)通路途徑誘導(dǎo)MLH1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸腫瘤增殖的影響。第一部分雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的機(jī)制研究背景我們的前期研究結(jié)果表明,圍絕經(jīng)期女性的結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)源性MLH1蛋白表達(dá)水平與體內(nèi)血清雌激素濃度呈正相關(guān)關(guān)系,但其MSH2蛋白表達(dá)與血清雌激素濃度無(wú)明顯相關(guān)性。并且,體外研究發(fā)現(xiàn)雌激素可增強(qiáng)結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)MLH1表達(dá)水平,但對(duì)MSH2蛋白表達(dá)影響非常有限。本研究旨在探討雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的作用機(jī)制。方法1.在SW480、HT29和Lo Vo細(xì)胞中過(guò)表達(dá)雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ),經(jīng)由雌二醇(E2)或者牛血清結(jié)合的雌二醇(BSA-E2)處理,利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,RT Q-PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法從m RNA和蛋白質(zhì)的水平分別檢測(cè)MLH1的表達(dá)情況。2.根據(jù)UCSC(www.geome.ucsc.edu)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析MLH1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),然后利用PCR方法從人基因組DNA中克隆MLH1基因近端啟動(dòng)子(-1953/+53),并插入到雙熒光報(bào)告基因載體p GL3-Basic中,并命名為p GL3-Promoter-luc。然后運(yùn)用熒光報(bào)告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)的方法檢測(cè)MLH1基因啟動(dòng)子序列中是否存在雌激素應(yīng)答元件。結(jié)果1.E2在m RNA水平顯著增強(qiáng)三種結(jié)腸癌細(xì)胞株的MLH1基因表達(dá),但與之相比較,BSA-E2對(duì)該基因的表達(dá)影響非常微弱。此外,雌激素處理細(xì)胞的情況下,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)ERβ對(duì)MLH1在m RNA水平的表達(dá)上調(diào)具有協(xié)同作用(P0.001)。2.我們發(fā)現(xiàn)MLH1近端啟動(dòng)子序列存在雌激素相關(guān)作用位點(diǎn)。并且,半雌激素應(yīng)答元件與AP1結(jié)合位點(diǎn)在雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的調(diào)控過(guò)程中都非常重要。結(jié)論E2誘導(dǎo)MLH1表達(dá)是由ERβ介導(dǎo),通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。第二部分ERβ在體外和體內(nèi)發(fā)揮抑制結(jié)直腸腫瘤生長(zhǎng)的作用背景據(jù)報(bào)道,ERβ特異性激動(dòng)劑在體外和體內(nèi)具有抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用。另一方面,絕經(jīng)后雌激素替代治療降低了微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定及微衛(wèi)星穩(wěn)定型的結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在明確ERβ介導(dǎo)的MLH1表達(dá)上調(diào)是否能在體外和體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。方法1.si RNA-sh MLH1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480和Caco2細(xì)胞,同時(shí)伴隨或不伴隨ERβ過(guò)表達(dá),然后分別與溶劑、雌激素或雌激素加ERβ特異性拮抗劑PHTPP孵育,并用5-FU處理細(xì)胞。最后用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行雙側(cè)卵巢切除術(shù),然后采用AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌,并將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2組,每5只一組。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別接受DPN(1 mg/kg/日)和等體積溶劑皮下注射。16周后采用頸椎離斷法處死動(dòng)物,取結(jié)直腸,稱重并測(cè)量長(zhǎng)度,計(jì)算重量/長(zhǎng)度比值。3.將HT29細(xì)胞(5 x 106)注射到已切除雙側(cè)卵巢的裸鼠皮下,并將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3個(gè)組,每5只一組。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別接受DPN(1 mg/kg/日)、PHTPP(10-7 mol/日)和等體積溶劑皮下注射。使用以下公式對(duì)移植瘤體積進(jìn)行監(jiān)測(cè):體積=1/2×(最大直徑)×(最小直徑)2。最終取部分移植瘤組織進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果1.當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源性MLH1蛋白表達(dá)被抑制,5-FU處理后細(xì)胞活性未顯著降低。然而,過(guò)表達(dá)ERβ加E2處理,上調(diào)MLH1表達(dá)水平,從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性,細(xì)胞活性顯著下降。2.與溶劑注射組相比,DPN注射組的成瘤數(shù)量更少,結(jié)直腸平均重量/長(zhǎng)度比值更小。3.與溶劑注射組相比,DPN注射組的移植瘤平均體積和重量較前者小。同時(shí),蛋白免疫印跡檢測(cè)提示,DPN注射組移植瘤的MLH1蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和PHTPP注射組。結(jié)論ERβ通過(guò)上調(diào)MLH1表達(dá),增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性,并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生以及移植瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用。
[Abstract]:This study was aimed to investigate the mechanism of estrogen replacement therapy in colorectal cancer . This study was aimed to determine whether the expression of ER 尾 - mediated mRNA was significantly higher than that in control group and PHTPP group . The results showed that the expression level of tumor cells was significantly higher than that in control group and PHTPP group . Conclusion : The expression of ER 尾 - 1 in mice was significantly higher than that in control group and PHTPP group .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

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本文編號(hào)：1973494