本文選題：白細(xì)胞介素10 + 抗CD20單克隆抗體　； 參考：《青島大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1D)是一種以胰島素分泌絕對(duì)不足,胰島β細(xì)胞進(jìn)行性破壞為主要特征的自身免疫性疾病,終生皮下注射胰島素仍為目前治療的主要手段。但終生皮下注射胰島素給患兒帶來了巨大的痛苦,且患兒殘存的胰島β細(xì)胞功能越少,對(duì)胰島素的依賴性越大,血糖越不穩(wěn)定,那T1D的急慢性并發(fā)癥的發(fā)生越早,患兒預(yù)后越差。因此,積極保護(hù)T1D殘存胰島β細(xì)胞功能,具有十分重要的臨床意義。由于T1D是一種自身免疫性疾病,細(xì)胞及體液免疫功能紊亂都參與了T1D的發(fā)病過程,因此,本課題擬用腺病毒介導(dǎo)的IL-10基因恢復(fù)細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài),同時(shí)利用抗CD20單克隆抗體恢復(fù)體液免疫穩(wěn)態(tài),以期觀察聯(lián)合用藥對(duì)對(duì)NOD鼠T1D自然發(fā)病早期胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用,并研究其相關(guān)機(jī)制。本課題主要包含二部分內(nèi)容:第一部分富集與擴(kuò)增攜有鼠白細(xì)胞介素-10基因的重組腺病毒載體目的純化、富集、擴(kuò)增攜有鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)基因的重組腺病毒。方法從脂多糖(LPS)培養(yǎng)的大鼠脾細(xì)胞中提取細(xì)胞總的RNA,逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(q RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增IL-10 cDNA,將擴(kuò)增出的IL-10 cDNA克隆于pAdtrack-CMV載體中,即構(gòu)建出了pAdtrack-CMV-IL-10穿梭質(zhì)粒。對(duì)該質(zhì)粒行線性化處理,而后轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架結(jié)構(gòu)的BJ5183大腸桿菌中,即可獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-IL-10。用Lipofectamin包裝并轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞,收獲重組腺病毒Ad-IL-10。用熒光顯微鏡觀察,293細(xì)胞內(nèi)有無(wú)綠色熒光。作為對(duì)照組,用上述方法對(duì)Ad-GFP,即不含目的基因的空腺病毒載體也進(jìn)行擴(kuò)增。最后用快速腺病毒感染性滴度試劑盒測(cè)定病毒滴度。結(jié)果在HEK293細(xì)胞內(nèi),攜有綠色熒光蛋白和鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)基因的重組腺病毒綠色熒光表達(dá)明顯。富集并擴(kuò)增腺病毒后,用快速檢測(cè)腺病毒感染性滴度試劑盒,測(cè)定病毒滴度為1.0×1011pfu/ml。同樣,只攜有綠色熒光蛋白的腺病毒載體(Ad-GFP),在HEK293細(xì)胞內(nèi),也明顯表達(dá)綠色熒光。富集并擴(kuò)增空載體后,用相同試劑盒檢測(cè)空載體滴度為1.0×1011pfu/ml。結(jié)論成功富集與擴(kuò)增了攜有鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)基因的重組腺病毒載體及空載體(ad-gfp),為后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。第二部分腺病毒介導(dǎo)的il-10基因與抗cd20單克隆抗體聯(lián)合干預(yù)對(duì)發(fā)病早期非肥胖性糖尿病鼠(nod)鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究目的觀察腺病毒介導(dǎo)的il-10基因與抗cd20單克隆抗體聯(lián)合干預(yù)對(duì)發(fā)病早期非肥胖性糖尿病鼠(nod)鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究。方法選擇17-20周齡診斷t1d不超過3天的nod鼠35只,隨機(jī)分為抗cd20單抗單獨(dú)治療組、抗cd20+il-10聯(lián)合治療組(聯(lián)合組)、il-10單獨(dú)治療組(ad-il-10組)、空載體組(ad-gfp組)及生理鹽水對(duì)照組(ns組)。分別尾靜脈注射抗cd20單抗250ug,抗cd20單抗250ug+ad-il-10100ul,ad-il-10100ul,ad-gfp100ul,ns100ul,每3天1次,首劑加倍,共注射4次。期間密切監(jiān)測(cè)小鼠血糖水平。自最后1次給藥后,連續(xù)觀察9周,處死全部小鼠。用he染色法觀察胰島炎性浸潤(rùn)情況;tunel法檢測(cè)胰島β凋亡情況;elisa法測(cè)定nod鼠血清il-4、il-10、c肽、tnf-α、inf-γ水平及胰腺胰島素分泌情況;免疫組化法評(píng)估il-10、cd20的表達(dá)情況;qrt-pcr法檢測(cè)小鼠胰腺il-10、cd20、胰島素、bcl-2、bax基因表達(dá)情況;用westernblot法檢測(cè)胰腺pro-caspase3、cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9、bcl-2、bax等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果聯(lián)合組可降低小鼠血糖水平。聯(lián)合組小鼠胰島炎主要集中在0-1級(jí),ad-gfp組和ns組主要集中在2-3級(jí),聯(lián)合組可明顯降低nod鼠胰島炎分級(jí)。聯(lián)合組胰島β細(xì)胞凋亡率較il-10單獨(dú)組、ad-gfp組和ns組明顯減低,p均0.05。免疫組化示il-10可在胰島局部高表達(dá),cd20在聯(lián)合組表達(dá)減低。qrt-pcr結(jié)果示:il-10在il-10治療組和聯(lián)合組高表達(dá),cd20各組間表達(dá)無(wú)差異。聯(lián)合組胰島素基因高表達(dá),與其余各組相比,p均0.01;聯(lián)合組胰腺bcl-2基因表達(dá)明顯升高,而bax基因在聯(lián)合組胰腺表達(dá)最低,因此,聯(lián)合組bcl-2/baxmrna表達(dá)比值明顯高于其余各組,p0.01。westernblot結(jié)果示:聯(lián)合組pro-caspase3、cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9表達(dá)均低于ad-gfp和ns組,p0.05;聯(lián)合組bcl-2蛋白表達(dá)升高,bax蛋白表達(dá)降低,bcl-2/bax比值高于il-10單獨(dú)組、ad-gfp組和ns組p0.05。結(jié)論腺病毒介導(dǎo)的il-10基因在胰腺局部高表達(dá)。腺病毒介導(dǎo)的il-10基因與抗cd20單克隆抗體聯(lián)用,可促進(jìn)nod鼠胰島素的分泌,控制血糖,減輕胰島炎。聯(lián)合干預(yù)可以通過激活bcl-2抗凋亡通路,抑制tnf-α、inf-γ表達(dá),阻斷caspase-8--caspase-3和caspase-9--caspase-3凋亡通路,發(fā)揮對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用�？傊�,抗cd20單克隆抗體與il-10基因聯(lián)合干預(yù),可以降低發(fā)病早期nod鼠胰島β細(xì)胞的凋亡,對(duì)殘存胰島β細(xì)胞功能具有一定的保護(hù)作用。
[Abstract]:A recombinant adenovirus vector pAdtrack - CMV - IL - 10 was prepared by using recombinant adenovirus vector pAdtrack - CMV - IL - 10 . 鍒嗗埆灝鵑潤(rùn)鑴夋敞灝勬姉cd20鍗曟姉250ug,鎶梒d20鍗曟姉250ug+ad-il-10100ul,ad-il-10100ul,ad-gfp100ul,ns100ul,姣，

本文編號(hào)：1969057