本文選題：CDK2 + 肝癌�。� 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究目的近年來隨著腫瘤發(fā)病率的逐年增加,惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生存的慢性病之一。腫瘤的治療方法主要有手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、及腫瘤生物治療等。因近年來腫瘤患者對化學(xué)治療出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象逐年增加,使腫瘤患者對現(xiàn)有的化學(xué)藥物治療受到限制,開發(fā)新的化學(xué)治療藥物迫在眉睫。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)的激活與失活維持著細(xì)胞周期各時相有序進(jìn)行。CDK2磷酸化Rb是G1過渡到S期的關(guān)鍵步驟。抑制CDK2可以抑制腫瘤細(xì)胞的增生,為一個很好的抗腫瘤藥物靶點。計算機(jī)輔助藥物設(shè)計是一門使用計算機(jī)模擬分子作用,通過綜合運(yùn)用生物信息學(xué)工具,從而達(dá)到選取、發(fā)現(xiàn)候選新藥目的。利用計算機(jī)蛋白-配體對接軟件(idock)可以預(yù)測一個小分子非共價地結(jié)合到靶蛋白時,其最佳構(gòu)象和親和強(qiáng)度,通過其親和強(qiáng)度的打分高低可以篩選到目的蛋白抑制劑。本實驗利用蛋白-配體對接軟件從FDA注冊過的藥物數(shù)據(jù)庫篩選靶蛋白CDK2候選抑制藥物,可以大大節(jié)省設(shè)計新藥物的成本和時間。篩選到的靶蛋白CDK2候選抑制藥物并被隨后的體內(nèi)體外實驗室驗證其生物有效性。本實驗針對大腸癌、肝癌細(xì)胞對篩選出來的CDK2候選抑制劑進(jìn)行實驗室體內(nèi)、外驗證其對大腸癌、肝癌的治療作用,尋找治療大腸癌、肝癌的新型CDK2抑制劑。研究方法：(1) Redocking驗證idock軟件的準(zhǔn)確性、有效性。(2)利用蛋白-配體對接軟件(idock)找到CDK2靶蛋白的候選抑制劑。(3)通過MTT對初篩出來的候選藥物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制率的檢測,從而找到目的藥物。(4)對目的藥物進(jìn)行細(xì)胞周期實驗驗證其導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的作用。(5)通過流式細(xì)胞儀對目的藥物進(jìn)行細(xì)胞凋亡實驗驗證其對腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。(6)通過Western Blot實驗檢測目的藥物對細(xì)胞周期信號通路的相關(guān)蛋白CDK2、cyclinD1、cyclinB1、cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb的表達(dá)的影響。(7)檢測目的藥物對裸鼠移植瘤模型的治療作用,觀察其抗腫瘤效果。(8)蛋白-配體對接idock軟件結(jié)構(gòu)分析在分子水平說明目的藥物抑制CDK2的作用機(jī)理。研究結(jié)果：(1) Redocking結(jié)果顯示idock軟件相對同類的軟件的準(zhǔn)確性、有效性提高了7%,速度提高了8.69-37.51倍。(2)通過蛋白-配體對接軟件(idock)找到且購買到CDK2靶蛋白的候選抑制劑9個,并被隨后的體內(nèi)外實驗驗證其生物有效性。(3)通過MTT對初篩出來的候選藥物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制率的檢測,從而找到對大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO呈現(xiàn)時間及濃度梯度依賴性抑制效果最好的藥物Adapalene (IC50:4.43μM for DLD1,7.135μM for LOVO)。同時找到對肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7呈現(xiàn)時間及濃度依賴性抑制效果最好的藥物Fluspirilene(IC50:4.017μM for HepG2 and 3.468μM for Huh7)。(4)用Adapalene對大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO進(jìn)行細(xì)胞周期實驗,結(jié)果顯示Adapalene 30/10μM濃度呈現(xiàn)時間及濃度梯度依賴性G1期細(xì)胞阻滯增高趨勢。Fluspirilene 30/10μM濃度對肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7呈現(xiàn)時間及濃度梯度依賴性G1期細(xì)胞阻滯增高趨勢。(5) Adapalene 30/10μM濃度對大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO干擾后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測,結(jié)果顯示呈現(xiàn)時間及濃度梯度依賴性凋亡細(xì)胞數(shù)增高趨勢。Fluspirilene 30/10μM濃度干擾肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7呈現(xiàn)時間及濃度梯度依賴性凋亡細(xì)胞數(shù)增高趨勢。(6)Adapalene藥物干擾大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO后.Western Blot檢測CDK2、 cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb蛋白隨著藥物的濃度增加而呈現(xiàn)表達(dá)下降的趨勢,cyclinD1、cyclinB1蛋白的表達(dá)沒有改變。Fluspirilene干擾肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7后Western Blot檢測CDK2、cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb蛋白隨著藥物的濃度增加而呈現(xiàn)表達(dá)下降的趨勢,cyclinD1、cylinB1蛋白的表達(dá)沒有改變。(7) Adapalene對DLD1皮下成瘤BALB/C裸鼠移植瘤模型進(jìn)行藥物治療后,20mg/kg呈現(xiàn)明顯的抗腫瘤的效果。Fluspirilene對Huh7皮下成瘤BALB/C裸鼠移植瘤模型進(jìn)行藥物治療后,15mg/kg呈現(xiàn)明顯的抗腫瘤的效果。(8)利用分子對接及分子動力研究表明Adapalene主要通過疏水鍵Phe82、Ile10、 Leu134、Lys33、His84與CDK2競爭ATP口袋區(qū)結(jié)合位點；Fluspirilene主要通過疏水鍵Phe82、Ile10、Leu134、His84與CDK2競爭ATP口袋區(qū)結(jié)合位點。結(jié)論：本實驗利用了計算機(jī)蛋白-配體對接idock軟件篩查CDK2靶蛋白抑制劑候選藥物及進(jìn)一步體內(nèi)體外實驗室驗證其生物有效性。我們找到了抗大扇癌的藥物Adapalene及抗肝癌藥物Fluspirilene。Adapalene通過疏水鍵Phe82、Ile10、 Leu134、Lys33、His84與CDK2競爭ATP口袋區(qū)結(jié)合位點,從而抑制了CDK2的活性；Fluspirilene通過疏水鍵Phe82、Ile10、Leu134、His84與CDK2競爭ATP口袋區(qū)結(jié)合位點,從而抑制了CDK2的活性。通過抑制CDK2/cyclinE及Rb細(xì)胞周期通路從而使細(xì)胞大量的阻滯在G1期,并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,延緩腫瘤細(xì)胞的生長。Adapalene及Fluspirilene表現(xiàn)出了良好口服活性劑和較低的毒性,可以成為潛在的抗大腸癌及肝癌的很好的CDK2抑制劑靶向藥物。
[Abstract]:A new type of CDK2 inhibitor for the treatment of colorectal cancer and liver cancer has been developed . ( 6 ) The effect of target drugs on the expression of CDK2 , cyclin D1 , cyclin B1 , cyclin E , Rb , bcl - CDk2 and Rb - Rb in the cell cycle signal pathway was investigated by Western Blot . The results showed that the expression of CDK2 , cyclin E , Rb , bcl - CDk2 , cyclin D1 and cyclin B1 in HCC cell line HepG2 and Huh7 showed no change . ( 7 ) The expression of cyclin D1 and cyclin B1 did not change .
In this experiment , we have found that the drug Adapalene and anti - hepatoma drugs Flussurlene . Adapalene have been used to screen CDK2 target protein inhibitor candidate drugs and further in vitro laboratory to verify its biological effectiveness .
By inhibiting CDK2 / cyclin E and Rb cell cycle pathways to block the cell apoptosis and delay the growth of tumor cells , Adapalene and Flussurlene showed good oral and low toxicity , which could be a good targeting drug for CDK2 inhibitors against colorectal cancer and liver cancer .
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R979.1

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本文編號：1948298