本文選題：骨肉瘤 + 多藥耐藥��； 參考：《吉林大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:建立LIMK1激酶活性上調(diào)及下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG6/VCR細(xì)胞系,對(duì)比分析細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)特性的改變,為明確LIMK1在骨肉瘤耐藥細(xì)胞中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。方法:1.在MG63細(xì)胞中加入長(zhǎng)春新堿,初始濃度為500ng/ml沖擊,使骨肉瘤細(xì)胞MG63能在含長(zhǎng)春新堿(500ng/ml)的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng),整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程將耗費(fèi)時(shí)間大約6個(gè)月。最終獲得能在含有500ng/ml濃度長(zhǎng)春新堿的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)的骨肉瘤耐藥細(xì)胞,將其命名為MG63/VCR。以后將其在含有長(zhǎng)春新堿終濃度為100ng/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng),以維持耐藥株的表型,計(jì)算MG63、MG63/VCR細(xì)胞對(duì)常見(jiàn)化療藥物的半數(shù)抑制率和耐藥指數(shù)。2.建立LIMK1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MG6/VCR細(xì)胞系。通過(guò)G418篩選實(shí)驗(yàn)來(lái)確定G418最篩選濃度;應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,將含有LIMK1激酶活性上調(diào)、下調(diào)及空載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG6/VCR中,經(jīng)G418加壓篩選,得到穩(wěn)定LIMK1激酶活性上調(diào)的骨肉瘤耐藥細(xì)胞株(命名為CFP-LIMK1-WT,以下簡(jiǎn)稱為上調(diào)組)、LIMK1激酶活性下調(diào)的骨肉瘤耐藥細(xì)胞株(命名為YFPLIMK1-DA,以下簡(jiǎn)稱為下調(diào)組)及空載表達(dá)LIMK1基因的骨肉瘤耐藥細(xì)胞株(命名為MG63/VCR-E,以下簡(jiǎn)稱為空載體組)。并通過(guò)q RT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染效率,免疫沉降、Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證激酶活性,以確保獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。3.觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)后細(xì)胞形態(tài)改變,并進(jìn)行細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附等生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)研究。用CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線,研究對(duì)比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞增殖能力的差異。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的體外侵襲能力的變化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化、ELISA法檢測(cè)人纖維黏連蛋白檢測(cè)、通過(guò)細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞粘附能力的差異。結(jié)果:1.骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞MG63/VCR對(duì)長(zhǎng)春新堿有較高耐受,且顯示為中度耐藥細(xì)胞。同樣對(duì)紫杉醇、吡柔比星也呈現(xiàn)較高程度的交叉耐藥,其耐藥指數(shù)分別為377.67、32.85,而對(duì)耐藥指數(shù)為1.2的吉西他濱不敏感。說(shuō)明構(gòu)建的骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG63/VCR是中度耐藥細(xì)胞,同時(shí)具有多藥耐藥的特性。2.進(jìn)行G418濃度篩選實(shí)驗(yàn),篩選濃度在400μg/ml細(xì)胞全部死亡,并以此濃度作為后續(xù)篩選單克隆的作用濃度。3.q RT-PCR檢測(cè)上調(diào)組、下調(diào)組和空載組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)與MG6/VCR細(xì)胞組進(jìn)行對(duì)照,上調(diào)組及下調(diào)組細(xì)胞LIMK1基因表達(dá)明顯升高(P0.05)而空載組則無(wú)顯著性差異(P0.05)。4.免疫沉降及Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后LIMK1蛋白及活性變化。結(jié)果顯示:與MG6/VCR細(xì)胞組相比,上調(diào)組及下調(diào)組細(xì)胞LIMK1蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05);上調(diào)組活性明顯增強(qiáng),下調(diào)組活性明顯降低;而空載組蛋白表達(dá)及活性則差異無(wú)顯著性(P0.05)。5.CCK-8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果示證明了骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG-63/VCR的IC50值為450.4±36.4,耐藥指數(shù)為390.63是中度耐藥細(xì)胞,同時(shí)具有多藥耐藥的特性。七天生長(zhǎng)曲線圖顯示與MG63/VCR細(xì)胞組相比上調(diào)組細(xì)胞較MG63/VCR細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,而下調(diào)組細(xì)胞的體外增殖能力降低(P0.05)。6.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)組比MG63/VCR組具有明顯的促進(jìn)遷移作用;而下調(diào)組則能夠有效降低MG63/VCR的遷移(P0.05)。7.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)組G0/G1期細(xì)胞的比例增高(55.637±1.24),上調(diào)組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞的比例降低(42.535±1.07),空載體組和MG63/VCR組G0/G1期細(xì)胞的比例分別為46.183±1.13%和46.564±1.23,無(wú)明顯差別;分裂期細(xì)胞比例MG63/VCR組為39.593±1.21,下調(diào)組則下降(31.908±1.33,上調(diào)組增加(42.671±0.93),進(jìn)一步證明下調(diào)組抑制細(xì)胞分裂增殖,上調(diào)組促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖(P0.05)。8.細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比較,下調(diào)組粘附能力明顯增強(qiáng),上調(diào)組粘附能力明顯減弱,空載組未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。同時(shí)應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞人纖維連接蛋白FN表達(dá),結(jié)果顯示:下調(diào)組細(xì)胞的FN增高,上調(diào)組細(xì)胞的FN表達(dá)降低,進(jìn)一步說(shuō)明了各組細(xì)胞粘附能力的差異(P0.05)。結(jié)論:1.成功建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LIMK1激酶活性上調(diào)、下調(diào)、空載表達(dá)的三類骨肉瘤耐藥細(xì)胞系,為后續(xù)基因調(diào)控的實(shí)驗(yàn)提供了新的細(xì)胞模型。2.LIMK1激酶活對(duì)MG63/VCR細(xì)胞的增殖、遷移、粘附及侵襲能力等生物學(xué)特性就要有重要的調(diào)控作用。
[Abstract]:Objective : To establish a stable and down - regulated MG6 / VCR cell line of osteosarcoma cell line MG6 / VCR , which can stably grow in culture medium containing vinblastine ( 500 ng / ml ) . The cell line of osteosarcoma cell line MG63 and MG63 / VCR was stably transfected into osteosarcoma cell line MG6 / VCR . The results showed that the IC50 values of MG63 / VCR and MG63 / VCR were significantly higher than those in MG6 / VCR cells ( P0.05 ) . Down - regulation and no - load expression of three kinds of osteosarcoma - resistant cell lines provide a new cell model for the subsequent gene regulation experiments . 2 . The biological characteristics of the proliferation , migration , adhesion and invasion ability of MG63 / VCR cells are important to regulate the proliferation , migration , adhesion and invasion ability of MG63 / VCR cells .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738

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本文編號(hào)：1946552