本文選題：粗糙脈孢菌 + 組成性毒素合成酶��； 參考：《江蘇師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)是脈孢菌屬的一種多細(xì)胞絲狀真菌,其菌絲透明,并有分隔和分枝,菌絲疏松,呈網(wǎng)狀,能產(chǎn)生桔色分生孢子。粗糙脈孢菌生長快,易培養(yǎng),遺傳背景清晰,所以是實驗室普遍使用的模式真菌。前期研究發(fā)現(xiàn),粗糙脈孢菌通過合成組成性毒素(constitutive toxins,CT)來抵御昆蟲,并形成特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)儲存組成性毒素,避免對自身細(xì)胞造成傷害。利用antiSMASH預(yù)測,粗糙脈孢菌中合成組成性毒素的基因PKS5(polyketide synthase gene,PKS5)和編碼短鏈脫氫酶還原酶(DH)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(MFS-1,MFS-2)、細(xì)胞色素450(CYP-1,CYP450-2)、轉(zhuǎn)錄因子(TF)、硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SULT)等9個基因共同構(gòu)成了組成性毒素合成基因簇(CTNC)。CYP450是真菌體內(nèi)含量最多、功能最多的活性蛋白酶,能夠降解外源毒物以及自身有毒次級代謝產(chǎn)物。MFS參與調(diào)控,能夠?qū)⒕w產(chǎn)生的毒素排到細(xì)胞外發(fā)生作用。SULT將硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)發(fā)生同化反應(yīng),合成半胱氨酸,參與電位的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞基因表達(dá)過程中起著雙重調(diào)控作用:1.對絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)節(jié);2.對不利于自身的外來活性氧自由基信號傳導(dǎo)作出反應(yīng)。在本論文中,開展了以下研究:1.以粗糙脈孢菌Ku70突變株為出發(fā)菌株,將CTNC基因簇中的10個基因分別敲除,獲得10個突變菌株,通過薄層層析(TLC)檢測代謝產(chǎn)物變化情況。2.克隆基因PKS5并將其與pYH-WA-pyrG-KI載體連接,整合到模式真菌構(gòu)巢曲霉的WA位點(diǎn),通過PCR技術(shù)篩選突變菌株,并對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測。3.以cDNA為模板克隆TF基因,并將其與pETMALc-H載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌蛋白表達(dá)菌株BL21,誘導(dǎo)蛋白表達(dá),獲得相應(yīng)蛋白。用獲得的蛋白作為抗原注射家兔,從家兔的血清中獲得抗體。4.以粗糙脈孢菌Ku70突變株為出發(fā)菌株,對其TF基因進(jìn)行原位超強(qiáng)表達(dá),提取蛋白,通過Western Blot檢測TF基因的蛋白表達(dá)水平,TLC檢測次級代謝產(chǎn)物合成水平。結(jié)果顯示,粗糙脈孢菌的10株突變菌株中有4株顏色變?yōu)榘咨也划a(chǎn)生孢子,說明被敲除基因與孢子的形成有密切聯(lián)系。通過TLC檢測得出,突變菌株次級代謝產(chǎn)物數(shù)量減少。粗糙脈孢菌的PKS5基因整合到構(gòu)巢曲霉基因組WA位點(diǎn)后成功表達(dá),TLC和HPLC檢測結(jié)果顯示,突變型構(gòu)巢曲霉的次級代謝產(chǎn)物中有3種新物質(zhì)產(chǎn)生。大腸桿菌BL21成功表達(dá)出轉(zhuǎn)錄因子,并通過注射家兔獲得相應(yīng)抗體。提取TF超強(qiáng)表達(dá)菌株蛋白,Western Blot結(jié)果顯示TF超強(qiáng)表達(dá)菌株中TF基因的表達(dá)水平顯著上調(diào),TLC檢測顯示次級代謝產(chǎn)物的生成量顯著增加。
[Abstract]:Neurospora crassault, a multicellular filamentous fungus of the genus Cephalosporium, has transparent hyphae, separated and branched, loose hyphae, reticulate, and can produce orange color conidium. C. crassifolia is a model fungus widely used in laboratory because of its rapid growth, easy culture and clear genetic background. Previous studies have shown that C. crassifera protects against insects by synthesizing a constitutive toxin, and forms specific subcellular structures to store constitutive toxins, thus avoiding damage to its own cells. Using antiSMASH prediction, Nine genes, including PKS5(polyketide synthase gene PKS5), encoding short chain dehydrogenase reductase (DHH), transporter superfamily MFS-1 (MFS-2), cytochrome 450 (CYP-1) CYP450-2, transcriptional factor (TFN), sulfate radical transporter (SULT), etc. The toxin synthase gene cluster CTNCU. CYP450 was the most abundant in fungi. The most active protease can degrade exogenous poison and its own toxic secondary metabolites. MFS is involved in the regulation, and the toxin produced by bacteria can be discharged into the cell to produce extracellular effects. SULT can transport sulfate to the cells to produce assimilation reaction. Synthesis of cysteine, involved in the regulation of potential. Transcription factors play a dual role in regulating cell gene expression: 1. The secondary metabolites of filamentous fungi were regulated. The signal transduction of extraneous active oxygen species is not favorable to itself. In this paper, the following research is carried out: 1. The 10 genes in the CTNC gene cluster were knocked out and 10 mutant strains were obtained. The metabolites were detected by TLC. The gene PKS5 was cloned and ligated with pYH-WA-pyrG-KI vector and integrated into WA site of Aspergillus nestis. The mutant strain was screened by PCR and its secondary metabolites were detected. TF gene was cloned by using cDNA as template and ligated with pETMALc-H vector. The protein expression strain BL21 was transformed into E. coli protein expression strain BL21. The protein expression was induced and the corresponding protein was obtained. The antibody. 4. 4 was obtained from rabbit serum by injecting rabbit with the obtained protein as antigen. The TF gene of Ku70 was expressed in situ and the protein was extracted. The protein expression level of TF gene was detected by Western Blot and the secondary metabolite synthesis was detected by Western Blot. The results showed that 4 of the 10 mutant strains were white and did not produce spores, indicating that knockout genes were closely related to spores formation. TLC analysis showed that the number of secondary metabolites of mutant strains decreased. After the PKS5 gene was integrated into the WA site of Aspergillus nestis genome, the results of TLC and HPLC analysis showed that three new metabolites were produced in the secondary metabolites of Aspergillus mutans. E. coli BL21 was successfully expressed as transcription factor and the corresponding antibody was obtained by injection of rabbit. The results of Western Blot showed that the expression level of TF gene in TF super expression strain was significantly up-regulated. TLC analysis showed that the production of secondary metabolites was significantly increased.
【學(xué)位授予單位】：江蘇師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q936

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本文編號：1944474