本文選題：IPSC + 體細(xì)胞重編程　； 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景和研究目的:誘導(dǎo)體細(xì)胞逆分化為具有多能性的胚胎干細(xì)胞的過程稱之為細(xì)胞重編程�？茖W(xué)家們一直在努力探索細(xì)胞重編程的方法,以便將干細(xì)胞廣泛的應(yīng)用于科學(xué)研究以及臨床治療。一直以來對體細(xì)胞重編程方法的研究進(jìn)展有限,已知的方法,如細(xì)胞核移植,細(xì)胞融合以及干細(xì)胞去核提取物孵育體細(xì)胞的方法都存在缺陷,很難得到能夠發(fā)育為成熟胚胎的干細(xì)胞,并且存在道德、倫理的爭議。人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的成功制備給了科學(xué)家們新的希望。人工誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞是由日本科學(xué)家Yamanaka在2006年首次將4種多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc轉(zhuǎn)入體細(xì)胞中得到的,命名為人工誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(i PSC)。i PSC的發(fā)現(xiàn)不僅是人們應(yīng)用多能干細(xì)胞的希望,同樣也為人們提供了新的視角,探索將多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子引入細(xì)胞后,體細(xì)胞逆分化為多能干細(xì)胞以及多能干細(xì)胞維持干性的機(jī)理。但是,在這一過程中,何種因子參與重編程調(diào)控,有多少因子在多能性因子的內(nèi)源性表達(dá)上起到了關(guān)鍵的作用,如與多能基因Sox2和Oct4啟動子相互作用,在重編程中激化內(nèi)源性多能基因,目前依然是空白。本實(shí)驗的主要目的是找到細(xì)胞重編程過程中能夠參與Sox2和Oct4內(nèi)源性表達(dá),即能夠與Sox2和Oct4啟動子相互作用的因子,尤其是調(diào)控重編程的長鏈非編碼RNA(lnc RNA),進(jìn)而探討人工誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在形成過程中的機(jī)制,找到啟動這一過程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),以便提高重編程轉(zhuǎn)化效率,在未來更好的調(diào)控這一過程。研究方法:實(shí)驗中我們應(yīng)用了CRISPR-Cas9技術(shù)來探索誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞形成以及維持多能性可能的機(jī)制及原理。CRISPR-Cas9作為近10年來發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用十分廣泛的基因編輯工具,是由一段特異的長度大約20bp左右的RNA靶向序列-通用的結(jié)構(gòu)支架(sg RNA)和Cas9核酸內(nèi)切酶組成,通常用于靶向切除某些基因,起到研究或者治療的作用。CRISPR-Cas9的特點(diǎn)在于它的靶向性,因其攜帶的特異性sg RNA能夠特異性的結(jié)合在目的基因處,并將Cas9蛋白結(jié)合在該處,作為分離目的基因的媒介。我們首先轉(zhuǎn)入帶有Sox2、Oct4啟動子序列的sg RNA的Lenti-CRISPR質(zhì)粒,經(jīng)過篩選后獲得能夠穩(wěn)定攜帶Cas9-g RNA基因的細(xì)胞。通過細(xì)胞固定將Cas9蛋白、Sox2與Oct4啟動子特異性sg RNA以及能夠和啟動子結(jié)合的分子,如DNA、lnc RNA甚至是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)固定在一起形成復(fù)合物。我們的實(shí)驗中主要研究了能夠和Sox2與Oct4啟動子結(jié)合的DNA以及l(fā)nc RNA,由于RNA的穩(wěn)定性較低,所以兩者的方法略有不同。在研究和啟動子相互作用的DNA時,我們通過Cas9特異性抗體將Cas9復(fù)合物從超聲破碎后的細(xì)胞提取液中分離出來,通過解交聯(lián)解開復(fù)合物的聯(lián)接,并用DNA提純的方法獲得Cas IP DNA樣品,制作基因文庫,并應(yīng)用Ch IP-seq方法進(jìn)行測序。而在研究和啟動子相互作用的lnc RNA時,我們在固定細(xì)胞后,首先在細(xì)胞內(nèi)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA并用Biotin-CTP標(biāo)記,以便保證RNA分析的穩(wěn)定。然后重復(fù)Cas9抗原抗體反應(yīng)以及免疫共沉淀方法,之后利用生物素親和素的結(jié)合分離出被Biotin-CTP標(biāo)記的、參與Sox2、Oct4啟動子結(jié)合的lnc RNA,同樣進(jìn)行Ch IP-seq測序?qū)颖具M(jìn)行分析。研究結(jié)果:Cas IP、Ch IP-seq分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠和Sox2、Oct4啟動子結(jié)合的多種因子參與到了很多重要的細(xì)胞生理過程中。對測序結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)并且在PCR結(jié)果中證實(shí)了位于小鼠17號染色體上的Oct4基因與位于3號染色體上的Sox2基因啟動子在多個位點(diǎn)上存在相互作用,而Sox2/Oct4啟動子也和Sox2/Oct4基因本身在多個位點(diǎn)相互聯(lián)系,其中的啟動子與增強(qiáng)子區(qū)域能夠形成特異的啟動子-增強(qiáng)子染色質(zhì)內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。這種染色體之間以及染色體之內(nèi)形成的空間構(gòu)架只存在于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中,而并沒有在多能基因不表達(dá)的未重編程的小鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。這一結(jié)果證明了在體細(xì)胞重編程過程中,Oct4和Sox2,Sox2和Sox2以及Oct4和Oct4基因之間存在許多的相互作用,并且這些相互作用可能在促進(jìn)細(xì)胞重編程以及維持多能性上具有很重要的作用。同時在RT-Cas IP的Ch IP-seq測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了能夠與Sox2/Oct4基因啟動子相互作用的lnc RNA在IPSC和FBC中存在顯著差異。這一結(jié)果證明了這些lnc RNA能夠參與到細(xì)胞重編程過程中,并且通過調(diào)動Sox2/Oct4的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子到近端啟動子的過程在細(xì)胞重編程與多能性的維持上起到關(guān)鍵作用。實(shí)驗結(jié)論:通過Cas IP方法以及Ch IP-seq測序,我們發(fā)現(xiàn),位于3號染色體上的Sox2基因的啟動子與位于17號染色體上的Oct4基因以及Sox2基因形成遠(yuǎn)端增強(qiáng)子-啟動子-DNA環(huán)。使用RT-Cas IP-Seq測定發(fā)現(xiàn),一些長鏈非編碼RNA(lnc RNA),如Palr5,Palr8,Palr9具有結(jié)合DNA的能力并且主動參與Sox2-Oct4相互作用,調(diào)動遠(yuǎn)處增強(qiáng)子與近端啟動子形成染色質(zhì)環(huán),促進(jìn)核心多能性因子的表達(dá)。這種染色質(zhì)空間折疊在促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)以及維持多能性上具有很重要的作用。
[Abstract]:The research background and research aim : The process of inducing somatic cell reverse differentiation into multipotent embryonic stem cells is called cell reprogramming . The scientists have been trying to explore the methods of cell reprogramming so as to widely apply stem cells to scientific research and clinical treatment . In this paper , we have studied the mechanism and principle of the expression of endogenous multipotent stem cells in the process of reprogramming . The main aim of this experiment is to find out the mechanism and the principle of how many factors play a key role in the formation of multipotent stem cells and to maintain the ability of multipotent stem cells . The results showed that the promoter and the Sox2 / Oct4 promoter were able to interact with the Sox2 / Oct4 promoter . The results showed that the promoter and the Sox2 / Oct4 promoter were able to interact with the Sox2 / Oct4 promoter .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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1 張詩林;CRISPR-Cas9染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)揭示細(xì)胞重編程中多能基因Sox2、Oct4啟動子的DNA-IncRNA結(jié)合網(wǎng)絡(luò)[D];吉林大學(xué);2017年

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本文編號：1931654