本文選題：貽貝粘蛋白Mgfp-5基因 + 煙草�。� 參考：《西北大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：貽貝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein, MAP)是海洋軟體動(dòng)物貽貝(Mytilidae)足部的足絲腺分泌的一類(lèi)具有粘性的蛋白質(zhì),也稱(chēng)貽貝足絲蛋白(Mussel foot protein, Mfp),強(qiáng)粘性主要取決于蛋白中的3,4-二羥基苯丙氨酸(3,4-Dihydroxyphenyl L-Alanine,德Dioxyphenyla-lanin簡(jiǎn)稱(chēng)多巴,DOPA)分子基團(tuán)的含量。目前在組成足絲盤(pán)的粘蛋白類(lèi)型中,Mfp-5中DOPA含量高達(dá)25-30%,粘性最強(qiáng)。貽貝粘蛋白無(wú)毒害、無(wú)免疫原性且生物相容性好,其粘性、防水性及耐腐蝕性高,應(yīng)用范圍廣�，F(xiàn)用的貽貝粘蛋白主要是天然獲取,但是其易固化且含量低,難獲得、成本高,制約了其應(yīng)用。已有用原核表達(dá)(大腸桿菌Escherichia coli)及真核表達(dá)(巴斯德畢赤酵母Pichia pastor is)系統(tǒng)獲得基因工程重組的貽貝粘蛋白,但是表達(dá)量或者粘附性能均不如意。植物基因工程的真核蛋白合成途徑有較高級(jí)的蛋白糖基化和磷酸化等修飾,而且在規(guī)模化生產(chǎn)、安全性和生產(chǎn)成本方面也有較大優(yōu)勢(shì)。因此,我們嘗試在植物中表達(dá)地中海貽貝粘蛋白Mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5)基因。以模式植物煙草(Nicotiana tabacum L.)為受體,在建立煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的同時(shí),利用基因工程技術(shù)方法構(gòu)建含有Mgfp-5基因的植物表達(dá)載體pRI101-Mgfp,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,優(yōu)化轉(zhuǎn)化的條件,篩選培養(yǎng),得到轉(zhuǎn)化植株。借助PCR、RT-PCR分子生物學(xué)方法鑒定外源基因的整合和轉(zhuǎn)錄,獲得含有Mgfp-5基因的T,代轉(zhuǎn)基因植株,再經(jīng)SDS-PAGE分析、Western Blot鑒定,重組Mgfp-5蛋白可以在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中表達(dá)。所取得的主要研究結(jié)果如下：1.構(gòu)建了含Mgfp-5基因植物表達(dá)載體pRI101-Mgfp,將其轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404:前期獲得的pUC57-Mgfp載體(含有Mgfp-5基因和His-tag),設(shè)計(jì)引物將其一同克隆并嵌入植物表達(dá)載體pRI101-AN多克隆位點(diǎn)Nde I和Kpn I之間,構(gòu)建含有Mgfp-5基因的植物表達(dá)載體pRI101-Mgfp。 PCR、酶切鑒定為正確的pRI101-Mgfp載體凍融法轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中。2.建立了用于遺傳轉(zhuǎn)化的秦?zé)?5(Nicotiana tabacum L. Qinyan95)離體再生體系：秦?zé)?5葉片外植體在含有10 mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)約4周,可以100%誘導(dǎo)出長(zhǎng)勢(shì)好生長(zhǎng)健壯的大量不定芽：幼芽在附加0.1 mg/L NAA的MS的培養(yǎng)基上,10d左右就可以100%誘導(dǎo)出健壯的根。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中,優(yōu)化了影響遺傳轉(zhuǎn)化頻率的葉片預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間以及共培養(yǎng)時(shí)間的條件：葉片外植體在預(yù)培養(yǎng)3 d、農(nóng)桿菌菌液OD600=0.6、侵染10 min、共培養(yǎng)3 d,在附加20 mg/L的Kan濃度的選擇壓下可以獲得轉(zhuǎn)化植株。4.轉(zhuǎn)化植株中g(shù)fp-5基因的鑒定,獲得轉(zhuǎn)基因植株：分子生物學(xué)PCR、RT-PCR分析轉(zhuǎn)化植株,均檢測(cè)到外源Mgfp-5基因的目標(biāo)條帶260 bp。檢測(cè)的87株轉(zhuǎn)化植株(T0代)中,外源基因gfp-5整合率為74.7%,表達(dá)率為39.1%。收獲T0代種子,PCR、RT-PCR繼續(xù)跟蹤分析T1代抗性篩選的陽(yáng)性小苗,gfp-5基因仍然可以在基因水平上穩(wěn)定表達(dá)。T1代轉(zhuǎn)基因植株中,Tris-飽和酚法提取葉片總蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳、Western Blot鑒定,Mgfp-5蛋白可以在T1代轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)。
[Abstract]:Mussel Adhesive Protein ( MAP ) is a kind of sticky protein which is secreted by the foot of the foot of the marine mollusk , and it is also known as Mussel foot protein ( Mfp ) . The plant expression vector pRI101 - Mgfp containing Mgfp - 5 gene was cloned and embedded between Nde I and Kpn I of plant expression vector pRI101 - AN , and the plant expression vector pRI101 - Mgfp containing Mgfp - 5 gene was constructed . Agrobacterium - mediated transformation was carried out on MS medium containing 10 mg / L 6 - BA and 0.2 mg / L NAA .
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

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