本文選題：貽貝粘蛋白Mgfp-5基因 + 煙草�。� 參考：《西北大學》2016年碩士論文

【摘要】：貽貝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein, MAP)是海洋軟體動物貽貝(Mytilidae)足部的足絲腺分泌的一類具有粘性的蛋白質(zhì),也稱貽貝足絲蛋白(Mussel foot protein, Mfp),強粘性主要取決于蛋白中的3,4-二羥基苯丙氨酸(3,4-Dihydroxyphenyl L-Alanine,德Dioxyphenyla-lanin簡稱多巴,DOPA)分子基團的含量。目前在組成足絲盤的粘蛋白類型中,Mfp-5中DOPA含量高達25-30%,粘性最強。貽貝粘蛋白無毒害、無免疫原性且生物相容性好,其粘性、防水性及耐腐蝕性高,應用范圍廣�，F(xiàn)用的貽貝粘蛋白主要是天然獲取,但是其易固化且含量低,難獲得、成本高,制約了其應用。已有用原核表達(大腸桿菌Escherichia coli)及真核表達(巴斯德畢赤酵母Pichia pastor is)系統(tǒng)獲得基因工程重組的貽貝粘蛋白,但是表達量或者粘附性能均不如意。植物基因工程的真核蛋白合成途徑有較高級的蛋白糖基化和磷酸化等修飾,而且在規(guī)模化生產(chǎn)、安全性和生產(chǎn)成本方面也有較大優(yōu)勢。因此,我們嘗試在植物中表達地中海貽貝粘蛋白Mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5)基因。以模式植物煙草(Nicotiana tabacum L.)為受體,在建立煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的同時,利用基因工程技術方法構建含有Mgfp-5基因的植物表達載體pRI101-Mgfp,農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草,優(yōu)化轉(zhuǎn)化的條件,篩選培養(yǎng),得到轉(zhuǎn)化植株。借助PCR、RT-PCR分子生物學方法鑒定外源基因的整合和轉(zhuǎn)錄,獲得含有Mgfp-5基因的T,代轉(zhuǎn)基因植株,再經(jīng)SDS-PAGE分析、Western Blot鑒定,重組Mgfp-5蛋白可以在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中表達。所取得的主要研究結果如下：1.構建了含Mgfp-5基因植物表達載體pRI101-Mgfp,將其轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404:前期獲得的pUC57-Mgfp載體(含有Mgfp-5基因和His-tag),設計引物將其一同克隆并嵌入植物表達載體pRI101-AN多克隆位點Nde I和Kpn I之間,構建含有Mgfp-5基因的植物表達載體pRI101-Mgfp。 PCR、酶切鑒定為正確的pRI101-Mgfp載體凍融法轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中。2.建立了用于遺傳轉(zhuǎn)化的秦煙95(Nicotiana tabacum L. Qinyan95)離體再生體系：秦煙95葉片外植體在含有10 mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)約4周,可以100%誘導出長勢好生長健壯的大量不定芽：幼芽在附加0.1 mg/L NAA的MS的培養(yǎng)基上,10d左右就可以100%誘導出健壯的根。3.農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化中,優(yōu)化了影響遺傳轉(zhuǎn)化頻率的葉片預培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵染時間以及共培養(yǎng)時間的條件：葉片外植體在預培養(yǎng)3 d、農(nóng)桿菌菌液OD600=0.6、侵染10 min、共培養(yǎng)3 d,在附加20 mg/L的Kan濃度的選擇壓下可以獲得轉(zhuǎn)化植株。4.轉(zhuǎn)化植株中gfp-5基因的鑒定,獲得轉(zhuǎn)基因植株：分子生物學PCR、RT-PCR分析轉(zhuǎn)化植株,均檢測到外源Mgfp-5基因的目標條帶260 bp。檢測的87株轉(zhuǎn)化植株(T0代)中,外源基因gfp-5整合率為74.7%,表達率為39.1%。收獲T0代種子,PCR、RT-PCR繼續(xù)跟蹤分析T1代抗性篩選的陽性小苗,gfp-5基因仍然可以在基因水平上穩(wěn)定表達。T1代轉(zhuǎn)基因植株中,Tris-飽和酚法提取葉片總蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳、Western Blot鑒定,Mgfp-5蛋白可以在T1代轉(zhuǎn)基因植株中表達。
[Abstract]:Mussel Adhesive Protein ( MAP ) is a kind of sticky protein which is secreted by the foot of the foot of the marine mollusk , and it is also known as Mussel foot protein ( Mfp ) . The plant expression vector pRI101 - Mgfp containing Mgfp - 5 gene was cloned and embedded between Nde I and Kpn I of plant expression vector pRI101 - AN , and the plant expression vector pRI101 - Mgfp containing Mgfp - 5 gene was constructed . Agrobacterium - mediated transformation was carried out on MS medium containing 10 mg / L 6 - BA and 0.2 mg / L NAA .
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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