本文選題：茯苓 + RNA提取�。� 參考：《武漢輕工大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：茯苓Wolfiporia cocos是多孔菌科Polyporaceae,茯苓屬Wolfporia的地下菌核,在我國常作為藥食兩用的中藥材。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用不斷拓展,應(yīng)用現(xiàn)在分子生物技術(shù)研究真菌類中藥,已成為當(dāng)前中藥真菌的研究前沿。本課題采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),對在不同條件下的茯苓內(nèi)參基因進行篩選研究,以獲取合適的內(nèi)參基因校正目的基因的表達量,為研究茯苓基因的表達調(diào)控,揭示茯苓菌核的生物學(xué)特性,科學(xué)的指導(dǎo)茯苓種植提供了理論依據(jù)。本研究選取了10個內(nèi)參基因:28S核糖體RNA亞基(28S),18S核糖體RNA亞基(18S),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH),核糖體蛋白L4(RPL4),真核延伸因子1α(EF1-α),真核延伸因子1β(EF1-β),DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶亞基2(RPB2),肌動蛋白(ACT),微管蛋白α(α-TUB)和微管蛋白β(β-TUB)。利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測其在茯苓3個不同生長時期、2個不同組織以及在高鹽,高糖和高pH值等逆境條件下菌絲中的表達量,使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種內(nèi)參篩選軟件綜合分析,比較10個候選基因的表達穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如下:1、根據(jù)10條已公布的內(nèi)參基因序列設(shè)計引物,通過PCR擴增出10個內(nèi)參基因片段,在NCBI上經(jīng)BLAST比對后,發(fā)現(xiàn)10個內(nèi)參基因序列與其他物種同源基因具有高度相似性。2、在傳統(tǒng)Trizol法步驟中加入乙酸鈉、β-巰基乙醇進行體系優(yōu)化后,提取茯苓子實體3個不同發(fā)育階段的不同組織以及茯苓菌絲在不同脅迫條件下的總RNA。結(jié)果顯示,18S和28S兩條條帶分離清晰,帶型整齊。3、geNorm軟件分析顯示:在茯苓不同生長階段中,內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性為:28Sα-TUB18SRPB2GAPDHEF1-αβ-TUBRPL4EF1-βACT;NormFinder軟件分析結(jié)果為:GAPDH28S18SRPB2α-TUBRPL4EF1-αβ-TUBEF1-βACT;BestKeeper軟件分析結(jié)果則顯示最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為28S和GAPDH。綜合三個軟件分析得到的結(jié)果,推薦使用28S作為內(nèi)參基因。4、geNorm軟件分析顯示:在茯苓不同組織中,內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性為:α-TUBGAPDH28SRPL4EF1-αβ-TUB18SEF1-βRPB2ACT;NormFinder軟件分析結(jié)果為:28Sα-TUB18Sβ-TUBEF1-αGAPDHEF1-βRPB2RPL4ACT;BestKeeper軟件分析結(jié)果則顯示最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為α-TUB和28S。綜合三個軟件分析得到的結(jié)果,推薦使用α-TUB和28S作為內(nèi)參基因。5、geNorm軟件分析顯示:在不同逆境環(huán)境中,內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性順序為:GAPDHACT28SEF1-αα-TUB18SRPB2β-TUBEF1-βRPL4;NormFinder軟件分析結(jié)果為:ACT28SGAPDHRPB2EF1α18Sα-TUBEF1-ββ-TUBRPL4;BestKeeper軟件分析結(jié)果則顯示最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為GAPDH和ACT。綜合三個軟件分析得到的結(jié)果,推薦使用GAPDH和ACT作為內(nèi)參基因。6、geNorm軟件分析顯示:在茯苓所有樣品中,內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性順序為:GAPDHα-TUB28SRPB218Sβ-TUBACTEF1-βRPL4EF1-α;NormFinder軟件分析結(jié)果為:α-TUBRPB228SGAPDH18SEF1αACTβ-TUBRPL4EF1-β;BestKeeper軟件分析結(jié)果則顯示最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為α-TUB和RPB2。綜合三個軟件分析得到的結(jié)果,推薦使用α-TUB作為內(nèi)參基因。結(jié)論:本課題篩選出的GAPDH、α-TUB基因可以作為研究茯苓基因表達量的穩(wěn)定內(nèi)參基因,實驗結(jié)果為茯苓菌核的種植提供了工作基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , we selected 10 internal reference genes : 28S ribosomal RNA subunit ( 28S ) , ribosomal protein L4 ( RPL4 ) , eukaryotic extension factor 1偽 ( EF1 - 偽 ) , actin ( ACT ) , microtube protein 偽 ( 偽 - TUB ) and microtubular protein 尾 ( 尾 - TUB ) . The results obtained from three software analyses showed that : 偽 - TUBRPB228SGAPDH18SEF1 - TUBACTEF1 - 尾RPL4EF1 - 偽 ; and BestKeeper software analysis showed that 偽 - TUBRPB228SGAPDH18SEF1 - TUBTEF1 - 尾RPL4EF1 - 偽 was used as the internal reference gene .
【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S567.32

【參考文獻】

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1 黃鏡;熊果酸抗腫瘤作用及其機制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1997年

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本文編號：1918347